{"id":35321,"date":"2022-09-01T05:23:09","date_gmt":"2022-09-01T10:23:09","guid":{"rendered":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/cuantificacion-de-glicanos-para-el-descubrimiento-de-biomarcadores\/"},"modified":"2022-09-01T05:23:09","modified_gmt":"2022-09-01T10:23:09","slug":"cuantificacion-de-glicanos-para-el-descubrimiento-de-biomarcadores","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/cuantificacion-de-glicanos-para-el-descubrimiento-de-biomarcadores\/","title":{"rendered":"Cuantificaci\u00f3n de glicanos para el descubrimiento de biomarcadores"},"content":{"rendered":"

RICHARD CUMMINGSLos glicanos son parte de un elaborado sistema de comunicaci\u00f3n vital para el reconocimiento celular, las interacciones entre c\u00e9lulas, el transporte de prote\u00ednas, la defensa inmunitaria y m\u00e1s. Estas estructuras tridimensionales de az\u00facar adheridas a la mayor\u00eda de las prote\u00ednas codifican una gran cantidad de informaci\u00f3n que los investigadores apenas est\u00e1n comenzando a aprovechar (consulte \u00abObtenga su dosis de az\u00facar\u00bb, The Scientist<\/em>, abril de 2015). “Con los glicanos, hay varios niveles de informaci\u00f3n” dice Carlito Lebrilla, qu\u00edmico de la Universidad de California, Davis: el n\u00famero de posiciones que llevan un glucano, la ubicaci\u00f3n de cada uno de esos glucositos y la composici\u00f3n qu\u00edmica y la estructura de ramificaci\u00f3n de cada glucano. A pesar de ser la modificaci\u00f3n postraduccional m\u00e1s com\u00fan, la complejidad de la glicosilaci\u00f3n ha dejado a la glicobiolog\u00eda rezagada con respecto a otros campos, como el an\u00e1lisis de secuencias de prote\u00ednas y la gen\u00f3mica. Pero eso est\u00e1 cambiando, ya que los investigadores identifican la glicosilaci\u00f3n como un actor importante en muchas enfermedades, incluido el c\u00e1ncer. Un pu\u00f1ado de glicoprote\u00ednas aberrantes ya se utilizan como…<\/p>\n

Mejora del etiquetado<\/p>\n

Investigador:<\/strong> David Muddiman, Profesor, Departamento de Qu\u00edmica, Universidad Estatal de Carolina del Norte  <\/p>\n

Proyecto:<\/strong> Para investigar los cambios en las firmas de glicanos s\u00e9ricos en diferentes etapas del c\u00e1ncer de ovario.  <\/p>\n

Problema: <\/strong>Una forma f\u00e1cil y ampliamente utilizada de comparar la regulaci\u00f3n de glicanos en estados saludables y enfermos es liberar enzim\u00e1ticamente todos los glicanos en una muestra determinada de sus prote\u00ednas y analizarlos al por mayor. Los investigadores utilizan la espectrometr\u00eda de masas de marcado de is\u00f3topos estables para identificar la regulaci\u00f3n al alza o a la baja de ciertos glicanos entre las muestras. Los glicanos de una muestra reciben una etiqueta de is\u00f3topo ligero, como C12, mientras que en la otra muestra se adjunta un is\u00f3topo de carbono m\u00e1s pesado, como C13, y la abundancia relativa de cada ion revela la abundancia relativa de los glicanos marcados. Una forma com\u00fan de unir estos is\u00f3topos a los glicanos libres es agregar grupos metilo marcados con is\u00f3topos estables mediante un m\u00e9todo llamado permetilaci\u00f3n. Los datos generados a trav\u00e9s de esta t\u00e9cnica son muy variables, sin embargo, porque metila un n\u00famero variable de grupos hidroxilo de un glicano dado. No se necesita mucho para que la permetilaci\u00f3n sea dif\u00edcil de cuantificar, dice Muddiman. Cuanta m\u00e1s variabilidad anal\u00edtica tenga, menos capacidad tendr\u00e1 para extraer una firma biol\u00f3gica sutil.  <\/p>\n

Soluci\u00f3n:<\/strong> En 2013, Muddiman y sus colegas desarrollaron un flujo de trabajo para mejorar la reproducibilidad y la sensibilidad de la cuantificaci\u00f3n de glicanos mediante cromatograf\u00eda l\u00edquida-espectrometr\u00eda de masas (J Am Soc Mass Spectrom, 24:1376-84, 2013). Su t\u00e9cnica, denominada normalizaci\u00f3n de la individualidad al etiquetar con etiquetas isot\u00f3picas de hidrazida de glucano (INLIGHT), etiqueta los glucanos con una estequiometr\u00eda uno a uno, lo que reduce la variabilidad y mejora la sensibilidad del an\u00e1lisis cuantitativo. La etiqueta hidrof\u00f3bica tambi\u00e9n hace que los glicanos sean m\u00e1s f\u00e1ciles de ionizar, mejorando la detecci\u00f3n por espectrometr\u00eda de masas. En su estudio, el equipo public\u00f3 un c\u00f3digo que utiliza modelos multivariados para identificar glicanos individuales con abundancias significativamente diferentes entre muestras. Cualquiera puede simplemente tomar ese c\u00f3digo y modificarlo para su estudio, dice Muddiman.<\/p>\n

M\u00e1s tarde, su grupo us\u00f3 INLIGHT para identificar once glucanos plasm\u00e1ticos que estaban alterados en 82 mujeres con c\u00e1ncer de ovario en comparaci\u00f3n con los controles de casos (J Proteoma Res, 14:4394-401, 2015). El m\u00e9todo INLIGHT les permiti\u00f3 detectar cambios en la abundancia de glicanos tan bajos como el 17 por ciento. Ahora est\u00e1n usando la estrategia para analizar muestras de gallinas que desarrollan espont\u00e1neamente c\u00e1ncer de ovario en busca de glucanos cuya abundancia cambia a lo largo del curso de la enfermedad.<\/p>\n

Los reactivos INLIGHT est\u00e1n disponibles comercialmente en Cambridge Isotope Laboratories ( $950 por kit, alrededor de 25 experimentos). El equipo de Muddiman ahora est\u00e1 ajustando la polaridad de los reactivos para aumentar su se\u00f1al de espectrometr\u00eda de masas. Esta etiqueta ha sido tremenda para nosotros, pero \u00e9ramos cient\u00edficos, por lo que siempre queremos mejorar las cosas, dice.<\/p>\n

Glicanos en sus h\u00e1bitats naturales<\/p>\n

MAPEO: uso de masa de im\u00e1genes de desorci\u00f3n\/ionizaci\u00f3n l\u00e1ser asistida por matriz espectrometr\u00eda (MALDI IMS), Anand Mehta y sus colegas visualizaron dos glicanos que se sabe que est\u00e1n presentes en los ri\u00f1ones de los ratones (que se muestran en el gr\u00e1fico espectral anterior). Los investigadores liberaron los glucanos al exponer los ri\u00f1ones a una versi\u00f3n recombinante de la enzima PNGaseF (CE). Un control negativo (F) mostr\u00f3 que los glucanos no eran detectables a menos que se expusieran a la enzima. Los mapas de calor (C y D) mostraban la abundancia de cada glicano y una superposici\u00f3n de color (E) en la que un glicano es verde y el otro es p\u00farpura demostraba sus distribuciones en el borde exterior o centro de la secci\u00f3n de tejido.PLOS ONE<\/em>, doi:10.1371\/journal.pone.0106255, 2014<\/p>\n

Investigador: <\/strong>Anand Mehta, Profesor, Departamento de Farmacolog\u00eda Celular y Molecular; Richard Drake, Profesor, Departamento de Farmacolog\u00eda Celular y Molecular y Director, Centro de Prote\u00f3mica, Universidad M\u00e9dica de Carolina del Sur<\/p>\n

Proyecto:<\/strong> Identificar cambios en la glicosilaci\u00f3n de prote\u00ednas que puedan servir como biomarcadores tempranos de c\u00e1ncer de h\u00edgado.<\/p>\n

Problema:<\/strong> El an\u00e1lisis a granel de glucanos del suero o tejido homogeneizado no diferencia el tejido enfermo del tejido sano cercano. Cuando Mehta y sus colegas analizaron los perfiles de glicanos de tejido tumoral hepatocelular homogeneizado y tejido sano adyacente, no vieron ninguna diferencia detectable. As\u00ed que \u00e9l y Drake se dispusieron a mapear los glicanos dentro de muestras de tejido intactas fijadas con formalina o congeladas utilizando espectrometr\u00eda de masas de im\u00e1genes de desorci\u00f3n\/ionizaci\u00f3n l\u00e1ser asistida por matriz (MALDI IMS). El problema, dice, fue la liberaci\u00f3n enzim\u00e1tica de glicanos sin destruir el tejido o arruinar el banco. Los glucanos generalmente se liberan del tejido mediante la aplicaci\u00f3n de una enzima llamada p\u00e9ptido N-glucosidasa F (PNGasa F), pero rociar el tejido con la cantidad requerida era demasiado costoso. La falta de una enzima [asequible] fue una de las razones por las que nadie lo hab\u00eda hecho, dice Mehta.<\/p>\n

Soluci\u00f3n:<\/strong> Mehta y Drake dise\u00f1aron una versi\u00f3n recombinante de menor costo de PNGase F, que ahora est\u00e1 disponible comercialmente en Bulldog Bio ($ 250 por 100 microlitros), lo que reduce el costo del proceso tres veces a $ 1 por secci\u00f3n de tejido. (Anal Chem, <\/em>85:9799-806, 2013; PLOS ONE, <\/em>doi:10.1371\/journal.pone.0106255, 2014). El proceso MALDI IMS en s\u00ed mismo es similar al an\u00e1lisis prote\u00f3mico, dice Mehta. Los investigadores identificaron los glicanos por masa o por disociaci\u00f3n inducida por colisi\u00f3n en el tejido y crearon mapas de calor que revelaron la abundancia relativa de glicanos en el cerebro del rat\u00f3n y el tejido renal humano. Cuando aplicaron el m\u00e9todo a muestras de carcinoma hepatocelular, las diferencias entre los tumores y el tejido adyacente fueron sorprendentes, dice Mehta (Biomolecules, 5:2554-72, 2015).<\/p>\n

VER PARA CREER: Despu\u00e9s de liberar glicanos con un nueva enzima recombinante, Anand Mehta y sus colegas usaron MALDIIMS para visualizar los glucanos en muestras de tejido normal y con c\u00e1ncer de h\u00edgado. Los glicanos se identificaron por sus proporciones de masa a carga (m\/z) y los mapas de calor representaron las abundancias relativas de cada uno (A y B). Tambi\u00e9n se compararon los niveles de dos glicanos asignando colores a los glicanos individuales (rojo para el glicano en A y verde para el glicano en B) y superponiendo sus se\u00f1ales (C).BIOMOLECULES<\/em>, 5:2554-72 , 2015<\/p>\n

Dado que la t\u00e9cnica se basa en la masa, explica Mehta, no puede distinguir diferentes is\u00f3meros del mismo glicano. Sin embargo, \u00e9l y sus colegas est\u00e1n desarrollando enzimas recombinantes con especificidad isom\u00e9rica. Podemos usar esas enzimas para aclarar qu\u00e9 az\u00facares hay realmente all\u00ed, dice. Tambi\u00e9n han adaptado la t\u00e9cnica para detectar un glicano llamado \u00e1cido si\u00e1lico, que a menudo se destruye durante el an\u00e1lisis (Anal Chem, 88:5904-13, 2016), y un m\u00e9todo para emparejar los glicanos liberados con sus glicop\u00e9ptidos (Anal Chem, 88: 7745-53, 2016).<\/p>\n

Obteniendo detalles<\/p>\n

EN PUNTO: El equipo de Carlito Lebrillas us\u00f3 el monitoreo de m\u00faltiples reacciones para cuantificar los glucanos espec\u00edficos que todav\u00eda est\u00e1n unidos a los fragmentos pept\u00eddicos de las prote\u00ednas de inmunoglobulina s\u00e9rica. La t\u00e9cnica les permiti\u00f3 concentrarse en fragmentos espec\u00edficos (representados por picos de colores) que contienen glucanos conocidos y comparar la abundancia de cada glucop\u00e9ptido entre dos muestras.J. PROTEOME RES<\/em>, 14:5179-92, 2015<\/p>\n

Investigador:<\/strong> Carlito Lebrilla, Profesor, Departamento de Qu\u00edmica, Universidad de California, Davis<\/p>\n

Proyecto:<\/strong> Caracterizar la glicosilaci\u00f3n de prote\u00ednas s\u00e9ricas y de leche materna de individuos sanos y enfermos.<\/p>\n

Problema: <\/strong>La cuantificaci\u00f3n de glicanos libres por definici\u00f3n omite informaci\u00f3n sobre los niveles de prote\u00ednas anteriormente unidas a esos glicanos. Por lo general, dice Lebrilla, se sacrifica una forma de informaci\u00f3n por otra. Por ejemplo, puede determinar estructuras de ramificaci\u00f3n detalladas de glicanos libres individuales o cu\u00e1ntos sitios de uni\u00f3n de glicanos en una prote\u00edna est\u00e1n ocupados, pero generalmente no ambos.<\/p>\n

Soluci\u00f3n: <\/strong>Lebrilla se propuso idear una forma de cuantificar los glucanos en sitios espec\u00edficos de las glicoprote\u00ednas y distinguir los cambios en los niveles de glucanos de los cambios en los niveles de prote\u00ednas. Los miembros del laboratorio de Lebrillas dedican gran parte de su tiempo a mapear sistem\u00e1ticamente los sitios de glicosilaci\u00f3n en las prote\u00ednas comunes del suero y la leche materna. Tener tales mapas hizo posible usar un tipo de espectrometr\u00eda de masas llamada monitoreo de reacci\u00f3n m\u00faltiple (MRM) para comparar la abundancia de glicanos espec\u00edficos del sitio entre muestras. MRM utiliza un espectr\u00f3metro de masas de triple cuadrupolo, lo que permiti\u00f3 al equipo de Lebrillas localizar una especie de iones de inter\u00e9s y establecer los par\u00e1metros para optimizar la detecci\u00f3n de esa especie. Adem\u00e1s, utilizaron la ionizaci\u00f3n por electropulverizaci\u00f3n para aumentar la carga de los p\u00e9ptidos digeridos con tripsina, lo que los hace encajar dentro del estrecho rango de detecci\u00f3n de masas del instrumento de triple cuadrupolo. Debido a que MRM les permiti\u00f3 seleccionar qu\u00e9 iones medir, pudieron cuantificar muestras directamente del suero, lo que les permiti\u00f3 omitir el paso de enriquecimiento de prote\u00ednas que normalmente se requiere. Mientras su sensibilidad sea lo suficientemente buena, no importa qu\u00e9 m\u00e1s haya, dice Lebrilla.<\/p>\n

El equipo de Lebrilla us\u00f3 MRM para cuantificar glicoformas espec\u00edficas unidas a inmunoglobulinas (Anal Chem, 85:8585-93, 2013; J Proteome Res, 14:5179-92, 2015). Luego usaron la informaci\u00f3n para comparar la abundancia de p\u00e9ptidos glicosilados del suero donado por pacientes con c\u00e1ncer de ovario con los de controles sanos (J Proteome Res, 15: 1002-10, 2016) y probaron la utilidad de los perfiles de glicop\u00e9ptidos como un panel de biomarcadores potenciales. El grupo Lebrillas tambi\u00e9n est\u00e1 utilizando MRM para identificar biomarcadores de glicoprote\u00ednas espec\u00edficos de sitio en autoinmunidad y enfermedades metab\u00f3licas.<\/p>\n

Poniendo todo junto<\/p>\n

SEPARACI\u00d3N BASADA EN PERLAS: Hui Zhang y sus colegas desarrollaron extracci\u00f3n en fase s\u00f3lida de glicanos ligados a asparagina y p\u00e9ptidos que contienen glucositos (NGAG) para cuantificar glucanos y glicoprote\u00ednas de muestras complejas simult\u00e1neamente. Unieron glicop\u00e9ptidos digeridos a perlas de hidrazida (2) y usaron grupos de anilina para proteger los glicanos y los extremos carboxilo expuestos de las prote\u00ednas (3). La anilina tambi\u00e9n bloquea los grupos carboxilo en el \u00e1cido asp\u00e1rtico y el \u00e1cido glut\u00e1mico (no se muestra). Los p\u00e9ptidos permanecen adheridos a las perlas despu\u00e9s de que se liberan los glucanos (4), lo que permite separarlos mediante centrifugaci\u00f3n. <\/p>\n

Investigador: <\/strong>Hui Zhang, Profesor, Departamento de Patolog\u00eda y Director, Instalaci\u00f3n Central de Espectrometr\u00eda de Masas, Centro para el Descubrimiento y Traducci\u00f3n de Biomarcadores, Universidad Johns Hopkins<\/p>\n

Proyecto: <\/strong>Zhang desarrolla m\u00e9todos de alto rendimiento para analizar cambios en glicoprote\u00ednas s\u00e9ricas y tisulares asociadas con diferentes tipos de c\u00e1ncer.<\/p>\n

Problema: <\/strong>Hace quince a\u00f1os , Zhang desarroll\u00f3 una t\u00e9cnica llamada extracci\u00f3n en fase s\u00f3lida para cuantificar glicoprote\u00ednas e identificar sus sitios de uni\u00f3n a glucanos, pero solo despu\u00e9s de que se hubieran eliminado todos los glucanos. Esta limitaci\u00f3n a\u00fan se aplica a la mayor parte del campo: un laboratorio como Lebrillas puede estudiar glicop\u00e9ptidos intactos despu\u00e9s de que se hayan mapeado los glucositos, pero en su mayor parte, los laboratorios se enfocan en glucanos liberados o glucositos vac\u00edos en prote\u00ednas. Tratamos de integrar todas estas cosas en una sola tuber\u00eda, dice ella.<\/p>\n

Soluci\u00f3n:<\/strong> Zhang y sus colegas reelaboraron el m\u00e9todo de extracci\u00f3n en fase s\u00f3lida para que pudieran recopilar informaci\u00f3n sobre glucanos, glicoprote\u00ednas y glucositos, todo a la vez. (Nat Biotechnol<\/em>, 34:84-88, 2016). El m\u00e9todo, al que denominan extracci\u00f3n en fase s\u00f3lida de glicanos ligados a N y p\u00e9ptidos que contienen glicositos (NGAG), comienza con la uni\u00f3n de los glucop\u00e9ptidos digeridos a perlas de hidrazida y la estabilizaci\u00f3n de los p\u00e9ptidos y los glicanos unidos cubriendo cada grupo carboxilo y cada glicano con un compuesto qu\u00edmico llamado anilina. Debido a que los p\u00e9ptidos est\u00e1n adheridos a las perlas, los glucanos se pueden escindir y separar f\u00e1cilmente mediante centrifugaci\u00f3n en placas de 96 pocillos. La eliminaci\u00f3n del glicano revela un \u00e1cido asp\u00e1rtico donde se uni\u00f3 el glicano, y dado que todos los dem\u00e1s \u00e1cidos asp\u00e1rticos est\u00e1n ocultos por grupos de anilina, es f\u00e1cil identificar d\u00f3nde se unieron las cadenas de glicano\/oligosac\u00e1ridos. A continuaci\u00f3n, los p\u00e9ptidos se liberan de las perlas mediante una enzima que corta espec\u00edficamente el \u00e1cido asp\u00e1rtico expuesto.<\/p>\n

Despu\u00e9s de la separaci\u00f3n, los glicanos liberados y los p\u00e9ptidos identificados con glicositos se analizan mediante espectrometr\u00eda de masas en t\u00e1ndem. El equipo de Zhang us\u00f3 este m\u00e9todo para construir una base de datos con todas las posibles combinaciones de glucano-glucop\u00e9ptido en una muestra de una l\u00ednea celular de c\u00e1ncer de ovario. Tambi\u00e9n desarrollaron un programa llamado GPQuest, disponible en el sitio web de Zhang, biomarkercenter.org, que relaciona los glicanos identificados con sus sitios de uni\u00f3n a prote\u00ednas.<\/p>\n

El equipo de Zhang ahora usa NGAG para realizar glicoprote\u00f3mica en suero e identificar biomarcadores para Cancer de prostata. Tambi\u00e9n tiene la intenci\u00f3n de simplificar el m\u00e9todo en un kit listo para usar.  <\/p>\n

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RICHARD CUMMINGSLos glicanos son parte de un elaborado sistema de comunicaci\u00f3n vital para el reconocimiento celular, las interacciones entre c\u00e9lulas, el transporte de prote\u00ednas, la defensa inmunitaria y m\u00e1s. Estas estructuras tridimensionales de az\u00facar adheridas a la mayor\u00eda de las prote\u00ednas codifican una gran cantidad de informaci\u00f3n que los investigadores apenas est\u00e1n comenzando a aprovechar … Continuar leyendo \u00abCuantificaci\u00f3n de glicanos para el descubrimiento de biomarcadores\u00bb<\/span><\/a><\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"","ping_status":"","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[1],"tags":[],"class_list":["post-35321","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-general"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/35321","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=35321"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/35321\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=35321"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=35321"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.biblia.work\/articulos-salud\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=35321"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}