Cortes\u00eda de Matthew J. Lang<\/p>\n
Poco despu\u00e9s de la invenci\u00f3n del l\u00e1ser, el f\u00edsico Arthur Ashkin de Bell Labs comenz\u00f3 a explorar el rango de los nuevos dispositivos. \u00bfPodr\u00eda la fuerza de la luz en el haz mover un objeto, tanto como un dedo empuja una pelota, se pregunt\u00f3? Si lo hicieran, confirmar\u00eda una vieja teor\u00eda que lo hab\u00eda intrigado desde sus d\u00edas universitarios durante la Segunda Guerra Mundial.1 \u00abSe sab\u00eda que un l\u00e1ser pod\u00eda empujar [una part\u00edcula], la pregunta era, \u00bfpodr\u00eda observarlo?\u00bb Ashkin recuerda. Pero tambi\u00e9n descubri\u00f3 algo m\u00e1s: "Descubr\u00ed cuando hice eso, que hab\u00eda fuerzas que atra\u00edan las part\u00edculas hacia las regiones de alta intensidad del haz".<\/p>\n
As\u00ed naci\u00f3 el concepto de \u00abatrapamiento \u00f3ptico\u00bb, o "pinzas \u00f3pticas" – sistemas de l\u00e1seres y \u00f3pticas que pueden mantener estables objetos de escala microm\u00e9trica contra el movimiento browniano. Los experimentos realizados con tales sistemas ganar\u00edan el Nobel para varios f\u00edsicos…<\/p>\n
La captura \u00f3ptica es solo una de una clase de t\u00e9cnicas llamadas \u00abmanipuladores de campo externo, \u00bb que usan diferentes fuerzas de campo para controlar las biomol\u00e9culas.3 A veces esa fuerza es ligera y a veces es un campo magn\u00e9tico, pero al menos en una ocasi\u00f3n memorable, fue la gravedad. El investigador del Instituto M\u00e9dico Howard Hughes Carlos Bustamante de la Universidad de California, Berkeley, quien en 1992 us\u00f3 \u00abpinzas magn\u00e9ticas\u00bb para realizar la primera manipulaci\u00f3n directa de una sola mol\u00e9cula cuando midi\u00f3 la elasticidad del ADN,4 recuerda ese experimento de 1991: \u00abNuestro instrumento era el planeta Tierra\u00bb, dice, haciendo un remate de un experimento ahora cl\u00e1sico en el que su equipo adjunt\u00f3 mol\u00e9culas de ADN a un portaobjetos de vidrio en un extremo y a perlas microsc\u00f3picas en el otro. \u00abA medida que colocamos m\u00e1s y m\u00e1s cuentas en el extremo del ADN, se hundieron m\u00e1s en el agua y extendieron el ADN, por lo que la primera medici\u00f3n de extensi\u00f3n de fuerza de la elasticidad de una sola mol\u00e9cula se realiz\u00f3 mediante la fuerza gravitacional\u00bb.<\/p <\/p>\n
Las pinzas \u00f3pticas hacen un uso similar de las propiedades de la luz. El f\u00edsico del siglo XIX James Clerk Maxwell, famoso por las \u00abecuaciones de Maxwell\u00bb, predijo hace m\u00e1s de un siglo que una fuerza muy peque\u00f1a, llamada \u00abpresi\u00f3n de radiaci\u00f3n\u00bb, deber\u00eda estar asociada con la interacci\u00f3n de la luz con un material. Algunos investigadores exploraron la presi\u00f3n de la radiaci\u00f3n a principios del siglo XX, pero no fue hasta la llegada de los l\u00e1seres en la d\u00e9cada de 1960 que existieron fuentes de luz que pod\u00edan enfocarse lo suficientemente fuerte como para manipular un objeto muy peque\u00f1o.<\/p>\n
\u00abPuedes generar fuerzas significativas en una perla de poliestireno con una bombilla de 60 vatios\u00bb, observa Mark Williams, profesor asistente de f\u00edsica en la Universidad Northeastern en Boston. \u00abEs porque esa fuerza se ejerce sobre un objeto del tama\u00f1o de una micra que en realidad hace algo perceptible\u00bb.<\/p>\n
En otras palabras, las trampas \u00f3pticas deben lidiar con fuerzas en competencia. El atrapamiento es causado por la curvatura de la luz cuando se refracta; el cambio resultante en el impulso de los fotones provoca la atracci\u00f3n de la perla hacia el centro del punto l\u00e1ser. Si la luz se refleja en la superficie, tambi\u00e9n hay un cambio en el impulso en otras direcciones, lo que hace que la perla sea impulsada fuera de la trampa.<\/p>\n
Lo que realmente hace que las pinzas \u00f3pticas funcionen como una pr\u00e1ctica herramienta de laboratorio es la capacidad de medir con precisi\u00f3n la posici\u00f3n mientras se ejerce una fuerza. Si realmente puede medir la presi\u00f3n de radiaci\u00f3n, entonces puede controlar con precisi\u00f3n la fuerza para manipular la materia, exactamente como si estuviera trabajando con una herramienta mec\u00e1nica, como unas pinzas de metal. \u00abLa localizaci\u00f3n y la manipulaci\u00f3n son la parte crucial\u00bb, dice Ashkin.<\/p>\n
DOS LECTURAS SON MEJORES QUE UNO:<\/p>\n
Dise\u00f1o \u00f3ptico del instrumento combinado de captura \u00f3ptica y fluorescencia de una sola mol\u00e9cula de Steven Block, que muestra las v\u00edas de luz para el mercurio- transiluminaci\u00f3n de arco (verde claro), l\u00e1ser de captura (rojo oscuro), l\u00e1ser de detecci\u00f3n de posici\u00f3n (naranja), l\u00e1seres de excitaci\u00f3n de fluorescencia (azul oscuro, verde) y emisi\u00f3n de fluorescencia (rojo). Los fotodetectores incluyen un QPD, una c\u00e1mara anal\u00f3gica de velocidad de video, una c\u00e1mara EMCCD digital y un SAPD. Los obturadores electr\u00f3nicos proporcionan un control autom\u00e1tico del haz de captura (S1), el haz de excitaci\u00f3n de fluorescencia (S2), la iluminaci\u00f3n de campo brillante (S3) y la luz que ingresa al EMCCD\/SAPD (S4). M\u00faltiples filtros \u00f3pticos a\u00edslan la emisi\u00f3n del l\u00e1ser de diodo (F1) y bloquean las longitudes de onda del l\u00e1ser de trampa, detecci\u00f3n y excitaci\u00f3n antes de la detecci\u00f3n de fluorescencia (F2-F5). Los espejos Flipper alternan entre la c\u00e1mara de velocidad de video y el subsistema SMF (FM1) y eligen el detector SMF deseado (c\u00e1mara EMCCD o SAPD) (FM2). (De M. Lang et al., Nature Methods, 1:1339, 2004.)<\/p>\n
2004 Nature Publishing Group<\/p>\n
Fundamentalmente, un experimento con pinzas \u00f3pticas consiste en unir una biomol\u00e9cula a una perla atrapada y tirar de ella. Entonces es posible preguntarse, \u00bfcu\u00e1nta fuerza debo ejercer para disociar un complejo o desnaturalizar un \u00e1cido nucleico? La distancia que se mueve la cuenta es directamente proporcional a la fuerza aplicada y se denomina \u00abrigidez de trampa\u00bb. Es una manifestaci\u00f3n de alta tecnolog\u00eda de la Ley de Hooke, F = -kx, donde F es la fuerza, k es la rigidez de la trampa y x es el desplazamiento.<\/p>\n
\u00abUna trampa es un resorte tridimensional hecho de luz\u00bb, explica Block. \u00abSi el resorte est\u00e1 calibrado para cualquier fuerza que le apliques, puedes usarlo como una herramienta de medici\u00f3n. Al medir los movimientos de la perla con una precisi\u00f3n sorprendente, estamos infiriendo los movimientos de la mol\u00e9cula adherida a la perla\u00bb. \/p><\/p>\n
Por supuesto, eso es simplemente una simplificaci\u00f3n. \u00abLa \u00f3ptica de rayos funciona bien, siempre que la perla sea m\u00e1s grande que la longitud de onda de la luz\u00bb, dice Williams. \u00abCon perlas del orden de la longitud de onda de la luz, debe pensar en la fuerza de gradiente debido a un campo el\u00e9ctrico en un diel\u00e9ctrico, lo que lleva a c\u00e1lculos m\u00e1s complicados\u00bb.<\/p>\n
No existe tal cosa como un Configuraci\u00f3n de pinzas \u00f3pticas \u00abgen\u00e9ricas\u00bb, porque los l\u00edderes en el campo est\u00e1n refinando continuamente el m\u00e9todo. Hay, por ejemplo, configuraciones de uno, dos y m\u00faltiples haces, cuyas diferentes geometr\u00edas producen diferentes fuerzas en las perlas atrapadas.56 Con haces dobles, por ejemplo, puede trabajar m\u00e1s lejos de la lente, y as\u00ed trabajar m\u00e1s profundo en soluci\u00f3n.<\/p>\n
Aunque las pinzas magn\u00e9ticas y \u00f3pticas tienen ventajas y desventajas \u00fanicas, la manera general de distinguirlas, seg\u00fan Bustamante, es mediante qu\u00e9 t\u00e9cnica funciona mejor con qu\u00e9 nivel de fuerza. Las pinzas magn\u00e9ticas funcionan mejor con fuerzas muy bajas, por debajo de un piconewton (pN). Las pinzas \u00f3pticas son mejores con fuerzas entre 1 y 100 pN. La microscop\u00eda de fuerza at\u00f3mica tambi\u00e9n se usa en experimentos de una sola mol\u00e9cula; es mejor para fuerzas entre 100 pN y 1 nanonewton.<\/p>\n
Mara Prentiss de la Universidad de Harvard dice que su laboratorio se concentra m\u00e1s en pinzas magn\u00e9ticas, que facilitan mucho la replicaci\u00f3n de experimentos. \u00abLa mayor\u00eda de las pinzas \u00f3pticas solo atrapan una part\u00edcula a la vez\u00bb, escribe por correo electr\u00f3nico. \u00abDavid Grier de la [Universidad de Nueva York] ha fabricado pinzas que atrapan unas cuantas, y tambi\u00e9n hemos atrapado varias, pero es dif\u00edcil hacer cien o mil y tener una profundidad de trampa razonable\u00bb.<\/p>\n
Algunas empresas, como Cell Robotics de Albuquerque, N.Mex., y PALM Microlaser Technologies de Bernried, Alemania, ofrecen sistemas de pinzas \u00f3pticas preconstruidas. Pero, la mayor\u00eda de los laboratorios de investigaci\u00f3n organizan los suyos propios. Se puede crear un sistema de captura l\u00e1ser de nivel de ense\u00f1anza de un solo haz por unos pocos miles de d\u00f3lares. \u00abEs solo un objetivo de microscopio y una lente\u00bb, dice Williams sobre el sistema de $ 4,000 que cre\u00f3 a partir de partes \u00f3pticas y un diodo l\u00e1ser monomodo. \u00abNo quieres un ocular si est\u00e1s trabajando con l\u00e1seres\u00bb, agrega.<\/p>\n
Este sistema puede atrapar bacterias y levaduras, incluso mol\u00e9culas individuales. Pero si espera sorprenderlos en la Sociedad Biof\u00edsica, necesitar\u00e1 una combinaci\u00f3n completamente personalizada de \u00f3ptica, etapas piezoel\u00e9ctricas y l\u00e1seres controlados por computadora, que juntos cuestan seis cifras, y m\u00e1s que probable tiempo como posdoctorado con Block o Bustamante. . Jeff Gelles, profesor de la Universidad de Brandeis y colaborador de Block’s, dice que env\u00eda a sus alumnos al laboratorio de Block en Stanford para realizar experimentos que requieren mediciones calibradas con mucha precisi\u00f3n.<\/p>\n
En el laboratorio, el equivalente a desmontar un Lexus por piezas, algunos los laboratorios construyen sus sistemas destruyendo y modificando microscopios \u00f3pticos de alta gama. Otros simplemente construyen sus propios sistemas desde cero. Matthew Lang, profesor asistente de ingenier\u00eda biol\u00f3gica en el Instituto Tecnol\u00f3gico de Massachusetts, sugiere que una de las ventajas de comenzar con un microscopio est\u00e1ndar es que resulta familiar para los colaboradores externos y, por lo tanto, puede facilitar las operaciones b\u00e1sicas como cargar muestras.<\/p>\n
STRETCH \u00bfGENES?<\/p>\n
Este instrumento de pinzas \u00f3pticas de doble haz se utiliza para estirar el ADN. Los objetivos del microscopio enfocan dos rayos l\u00e1ser en el mismo lugar, atrapando una esfera de poliestireno. Para estirar el ADN, se sujeta por succi\u00f3n otra esfera de poliestireno en el extremo de una micropipeta de vidrio. A medida que la mol\u00e9cula de ADN se estira al mover la micropipeta, ejerce una fuerza sobre la esfera atrapada, lo que hace que se mueva ligeramente. La distancia que recorre es proporcional a la fuerza ejercida por el estiramiento. La fuerza medida resultante revela informaci\u00f3n sobre la elasticidad, la estabilidad y la interacci\u00f3n de la mol\u00e9cula con el entorno.<\/p>\n
Cortes\u00eda de Mark C. Williams<\/p>\n
Los instrumentos de investigaci\u00f3n tienen subsistemas completos dedicados a la detecci\u00f3n de posici\u00f3n (detecci\u00f3n de desplazamiento). Y no es imposible tener un instrumento con cinco o incluso m\u00e1s fuentes de luz, seg\u00fan Block. \u00abUno para realizar la captura, otro para la detecci\u00f3n de posici\u00f3n, otro para la excitaci\u00f3n de fluorescencia y tal vez otro para otro color de excitaci\u00f3n de fluorescencia, adem\u00e1s de una l\u00e1mpara de arco de mercurio para proporcionar iluminaci\u00f3n\u00bb.<\/p>\n
El desaf\u00edo para El experimento de resoluci\u00f3n de un solo angstrom de Block fue una estabilidad extrema para el instrumento. \u00abSi su sistema se desv\u00eda, termina midiendo su sistema, pero no el objeto de inter\u00e9s\u00bb, dice Block. \u00abSe mide que algo se mueve, pero no la enzima… El verdadero punto clave es que se necesita un sistema que sea ultraestable, sin deriva\u00bb.<\/p>\n
\u00c9l explica el desaf\u00edo de la f\u00edsica b\u00e1sica: \u00abSi Si propagas un rayo l\u00e1ser a trav\u00e9s del aire, el rayo l\u00e1ser parpadear\u00e1 un poco. Se mover\u00e1 hacia arriba y hacia abajo en cantidades muy, muy peque\u00f1as, y lo hace por la misma raz\u00f3n por la que parpadea una estrella: porque hay fluctuaciones de densidad en el aire. y las fluctuaciones de densidad dan lugar a cambios en el \u00edndice de refracci\u00f3n, y estos act\u00faan un poco como una lente para desviar el haz de luz\u00bb. Normalmente, en microscop\u00eda de luz, las fluctuaciones de densidad son demasiado peque\u00f1as para ser un problema, pero ese no es el caso en el nivel de angstrom. Block dice que su laboratorio \u00abha ido al extremo en los \u00faltimos a\u00f1os para construir un sistema que no est\u00e9 sujeto a la deriva\u00bb.<\/p>\n
Una soluci\u00f3n aparentemente obvia, poner todos los instrumentos en el vac\u00edo, crea su propio desaf\u00edos complicados y engorrosos, dice Block, por lo que su equipo hizo lo siguiente mejor: usaron helio, que tiene un \u00edndice de refracci\u00f3n mucho m\u00e1s cercano al del vac\u00edo que el del aire, por lo que peque\u00f1os cambios en la presi\u00f3n no desviar\u00edan la luz.<\/p>\n
\u00abUsando luz dispersa, podemos medir el centro de una de las perlas a un tama\u00f1o mucho m\u00e1s peque\u00f1o que el l\u00edmite de resoluci\u00f3n del microscopio \u00f3ptico, ya sea mediante interferometr\u00eda o detecci\u00f3n de plano focal posterior\u00bb, dice Block.<\/p>\n
Tom Perkins, miembro asociado de JILA, un instituto de investigaci\u00f3n con sede en Boulder, Colorado, administrado conjuntamente por el Instituto Nacional de Est\u00e1ndares y Tecnolog\u00eda y la Universidad de Colorado, adopt\u00f3 un enfoque diferente para lograr una resoluci\u00f3n de un solo angstrom.7 A diferencia del de Block sistema, que se desacoplaba de la superficie del cubreobjetos para Para reducir el ruido inherente, Perkins us\u00f3 un segundo l\u00e1ser para medir el ruido de la superficie y luego lo sustrajo en tiempo real. \u00abSi puede configurar un ensayo en el que pueda recoger todo de la superficie, entonces la t\u00e9cnica de Steve es una muy buena opci\u00f3n\u00bb, dice Perkins, \u00abpero para los ensayos que est\u00e1n inherentemente acoplados a la superficie, la nuestra funcionar\u00eda mejor\u00bb. <\/p>\n
Aunque gran parte de la bioqu\u00edmica de una sola mol\u00e9cula se ha logrado con trampas \u00f3pticas, existen otras formas de abordar estos problemas. Uno involucra el monitoreo preciso de sondas fluorescentes, por ejemplo, en la superficie de un motor molecular.<\/p>\n
Algunos investigadores ahora est\u00e1n construyendo sistemas compuestos que combinan tales mediciones con atrapamiento \u00f3ptico. Toshio Yanagida de Jap\u00f3n realiz\u00f3 un trabajo pionero en 1998, utilizando un pedestal microfabricado para separar las trampas \u00f3pticas de la ubicaci\u00f3n de la fluorescencia para evitar el fotoblanqueo. M\u00e1s recientemente, Block y Lang, su antiguo postdoctorado, demostraron que es posible combinar captura y fluorescencia en el mismo lugar y en la misma mol\u00e9cula.8<\/p>\n
Al comentar sobre varias t\u00e9cnicas de manipulaci\u00f3n de mol\u00e9culas individuales, a partir de trampas \u00f3pticas desde pinzas magn\u00e9ticas hasta microscop\u00eda de fuerza at\u00f3mica, Julio Fern\u00e1ndez de la Universidad de Columbia, dice: \u00abLa instrumentaci\u00f3n tiene un largo camino por recorrer, pero al final de ese camino, va a revolucionar nuestra comprensi\u00f3n de las prote\u00ednas. Va a cambiar la forma en que los libros est\u00e1n escritos\u00bb.<\/p>\n
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