ARRIBA: ISTOCK.COM, TRAFFIC_ANALYZER<\/p>\n
En menos de una d\u00e9cada desde su adaptaci\u00f3n a una t\u00e9cnica de edici\u00f3n del genoma, se ha utilizado CRISPR-Cas9 en animales de laboratorio y c\u00e9lulas de todo el mundo, as\u00ed como en c\u00e9lulas humanas que ya se est\u00e1n probando en ensayos cl\u00ednicos para tratar enfermedades. Los usuarios de CRISPR reconocen ampliamente las limitaciones, como las ediciones fuera del objetivo, y los investigadores han estado trabajando para minimizarlas con ajustes en el m\u00e9todo.<\/p>\n
Agregando a la lista de problemas que pueden ocurrir con CRISPR, un equipo de Los investigadores ahora informan una alta frecuencia de duplicaciones no deseadas al dise\u00f1ar inserciones gen\u00e9ticas en ratones. De manera preocupante para los cient\u00edficos, las inserciones no pudieron detectarse mediante el an\u00e1lisis de PCR est\u00e1ndar. Los hallazgos se publicaron la semana pasada (12 de febrero) en Science Advances<\/em>.<\/p>\n [Este art\u00edculo] es otra advertencia sobre el uso de la edici\u00f3n de genes basada en CRISPR-Cas9 para [knock-in ], comenta Ed Bolt, bi\u00f3logo molecular de la Universidad de Nottingham que no particip\u00f3 en el estudio.<\/p>\n La investigaci\u00f3n comenz\u00f3 cuando el investigador de inmunolog\u00eda Johannes Roth y sus colegas de la Universidad de Mnster en Alemania estaban investigando la funci\u00f3n del gen S100A8<\/em>que codifica una prote\u00edna que se une al calcio en las c\u00e9lulas inmunitarias mediante la ingenier\u00eda gen\u00e9tica de ratones en los que el gen no se expres\u00f3 en ciertos tejidos.<\/p>\n Sorprendentemente, encontraron que 30 de casi 50 animales ten\u00edan m\u00faltiples copias de la construcci\u00f3n insertada, en lugar de una sola.<\/p>\n<\/blockquote>\n Para dise\u00f1ar tales nocauts condicionales, el equipo, que inclu\u00eda a Boris Skryabin y sus colegas en el instalaci\u00f3n central de animales transg\u00e9nicos y modelos de ingenier\u00eda gen\u00e9tica en la Universidad de Mnster, fo permiti\u00f3 un enfoque popular. Esto implica reemplazar el gen original con una construcci\u00f3n en la que S100A8 <\/em>est\u00e1 flanqueado por secuencias espec\u00edficas que dirigen a una enzima particular para extirpar el gen. Esto conducir\u00e1 a la desactivaci\u00f3n del gen en tejidos particulares una vez que estos ratones se crucen con otros animales transg\u00e9nicos que expresan la enzima solo en los tejidos de inter\u00e9s.<\/p>\n Los investigadores inyectaron la construcci\u00f3n en ovocitos de rat\u00f3n fertilizados. , junto con la enzima Cas9 que corta el ADN y su gu\u00eda CRISPR. En los 34 cachorros editados gen\u00e9ticamente resultantes, realizaron un an\u00e1lisis de PCR est\u00e1ndar y otra forma m\u00e1s especializada de PCR para verificar si la construcci\u00f3n se insert\u00f3 correctamente. Para su sorpresa, los resultados sugirieron que solo dos de los cachorros parec\u00edan tener la inserci\u00f3n correcta, el resto ten\u00eda deleciones del gen o ten\u00eda genomas inalterados.<\/p>\n Pregunt\u00e1ndose por qu\u00e9 la construcci\u00f3n se integr\u00f3 en tan pocos genomas de animales, el El equipo cruz\u00f3 uno de los ratones con animales de tipo salvaje y estudi\u00f3 la descendencia resultante. Esta vez, utilizaron una combinaci\u00f3n de PCR est\u00e1ndar, secuenciaci\u00f3n gen\u00e9tica y PCR cuantitativa. Este enfoque m\u00e1s completo revel\u00f3 que, en general, siete ratones ten\u00edan la inserci\u00f3n correcta. Para sorpresa a\u00fan mayor de los investigadores, el resto de los animales llevaban hasta tres duplicados de la construcci\u00f3n insertada. Esto les llev\u00f3 a sospechar que tales duplicaciones podr\u00edan ser bastante comunes, tanto en los ratones parentales como en su descendencia, y que la forma est\u00e1ndar de PCR que se usa a menudo para analizar tales construcciones las estaba pasando por alto.<\/p>\n El equipo luego examin\u00f3 el genomas de ratones criados a partir de ratones de tipo salvaje cruzados con animales transg\u00e9nicos en los que otro gen, IL4<\/em>, hab\u00eda sido eliminado condicionalmente. Aqu\u00ed, usaron una forma especializada de PCR que a trav\u00e9s de un dise\u00f1o cuidadoso de cebadores es espec\u00edficamente adecuada para amplificar secuencias repetitivas.<\/p>\n Sorprendentemente, encontraron que 30 de casi 50 animales ten\u00edan m\u00faltiples copias de la construcci\u00f3n insertada, en lugar de que uno solo. Por el contrario, cuando repitieron el an\u00e1lisis con PCR est\u00e1ndar, encontraron multiplicaciones en solo cinco animales, lo que confirma la idea de que la PCR est\u00e1ndar no detecta las secuencias duplicadas. Los enfoques regulares de PCR no le permiten identificarlos, explica Skryabin.<\/p>\n La hibridaci\u00f3n de transferencia Southern, una t\u00e9cnica muy adecuada para cuantificar el n\u00famero de copias de secuencias de ADN espec\u00edficas, pudo confirmar las duplicaciones, tanto en los padres ratones y su descendencia. En general, los investigadores encontraron duplicaciones en nueve de diez grupos de ratones con diferentes inserciones dise\u00f1adas. Y en casi 150 cr\u00edas criadas a partir de cruces de animales de tipo salvaje y transg\u00e9nicos, el 57 por ciento albergaba m\u00faltiples copias.<\/p>\n La mayor\u00eda de los investigadores experimentados en el campo probablemente est\u00e9n al tanto de este problema.<\/p>\n Katharina Boroviak, Instituto Sanger<\/p><\/blockquote>\n Sin utilizar t\u00e9cnicas adecuadas para detectar tales duplicaciones, los investigadores pueden no darse cuenta de que las mutaciones no deseadas acechan en los genomas de sus organismos modelo, se\u00f1alan Skryabin y su colega Timofey Rozhdestvensky, un especialista en ratones transg\u00e9nicos. Para los investigadores que generan modelos de ratones knockout condicionales, las duplicaciones podr\u00edan hacer que las prote\u00ednas se eliminen efectivamente en todos los tejidos o producir otros efectos adversos, poniendo en peligro los estudios funcionales de los genes.<\/p>\n Skryabin y Rozhdestvensky dicen que sus hallazgos podr\u00edan tener relevancia para la edici\u00f3n de genes en todos los reinos de la vida, desde las plantas hasta las c\u00e9lulas humanas. Las duplicaciones de alguna manera podr\u00edan conducir a peligrosas mutaciones de cambio de marco, dar como resultado prote\u00ednas deformadas o causar efectos no deseados graves en los enfoques de terapia g\u00e9nica humana, escriben los dos a The Scientist<\/em> en un correo electr\u00f3nico.<\/p>\n The los autores recomiendan que los investigadores que dise\u00f1en cualquier inserci\u00f3n gen\u00e9tica con CRISPR investiguen si los genomas se editaron correctamente utilizando formas especializadas de an\u00e1lisis de PCR, transferencias Southern o nuevos m\u00e9todos de secuenciaci\u00f3n del genoma completo que son capaces de analizar secuencias repetitivas, para investigar si los genomas se editaron correctamente.<\/p>\n Katharina Boroviak, ingeniera gen\u00f3mica del Instituto Sanger en el Reino Unido que no particip\u00f3 en la nueva investigaci\u00f3n, no est\u00e1 sorprendida por los hallazgos. Ella tambi\u00e9n ha observado duplicaciones de secuencias insertadas en su laboratorio mientras generaba modelos de ratones transg\u00e9nicos. La mayor\u00eda de los investigadores experimentados en el campo probablemente est\u00e9n al tanto de este problema, agrega.<\/p>\n Los investigadores var\u00edan en las t\u00e9cnicas que usan para hacer inserciones de ADN y, por lo tanto, necesitan usar diferentes m\u00e9todos anal\u00edticos para asegurarse de que las ediciones se realicen correctamente. , ella agrega. En su laboratorio, por ejemplo, solemos hacer PCR cuantitativa y un panel completo de PCR reales para asegurarnos de que estamos reproduciendo el rat\u00f3n correcto y no depender de un solo modo de PCR, dice.<\/p>\n Aunque muchos laboratorios toman las medidas apropiadas de control de calidad, es bueno que alguien haya publicado al respecto, dice ella. [La publicaci\u00f3n] hace que los laboratorios m\u00e1s peque\u00f1os que realmente no han pensado mucho en ello sean tan conscientes de ello, dice Boroviak. Todo el mundo sigue hablando de lo genial que es CRISPR y de lo maravilloso y f\u00e1cil que es. Pero si empiezas a profundizar en los detalles. . . puede ver qu\u00e9 es lo que realmente sale mal y con qu\u00e9 frecuencia realmente sale mal, m\u00e1s a menudo de lo que piensa.<\/p>\n Para Bolt, los hallazgos subrayan la necesidad de comprender mejor los procesos de reparaci\u00f3n del ADN. Si bien en la superficie CRISPR-Cas9 es una herramienta simple de edici\u00f3n del genoma, se basa en la reparaci\u00f3n del ADN para funcionar, un proceso que es terriblemente complejo, dice. Cuando la enzima Cas9 corta el genoma de una c\u00e9lula, activa la maquinaria de reparaci\u00f3n gen\u00e9tica. En el caso de las inserciones de ingenier\u00eda, por ejemplo, se activa el proceso de reparaci\u00f3n dirigida por homolog\u00eda, mediante el cual la c\u00e9lula usa una plantilla de ADN para llenar el vac\u00edo que ha dejado la enzima Cas9, creando una inserci\u00f3n.<\/p>\n Los investigadores no tienen una buena comprensi\u00f3n de c\u00f3mo funciona ese proceso, ni c\u00f3mo podr\u00eda conducir a duplicaciones no deseadas, dice Bolt, que se especializa en la inestabilidad del genoma. Eso ser\u00e1 crucial para entender si los investigadores quieren encontrar formas de evitar el problema y mejorar la precisi\u00f3n de edici\u00f3n de CRISPR-Cas9, algo en lo que Rozhdestvensky y Skryabin ahora est\u00e1n trabajando.<\/p>\n Debemos tener claro que CRISPR-Cas9 es un m\u00e9todo realmente poderoso para la eliminaci\u00f3n de genes y para comprender la biolog\u00eda, dice Bolt. Pero est\u00e1bamos muy lejos de entender c\u00f3mo se puede usar CRISPR-Cas9 para insertar ADN para knock-ins.<\/p>\n BV Skryabin et al., Las inserciones generalizadas de cabeza a cola de plantillas de ADN enmascaran el CRISPR deseado -Eventos de edici\u00f3n del genoma mediados por Cas9, <\/strong>Science Advances,<\/em><\/strong> doi:10.1126\/sciadv.aax2941, 2020. <\/strong> <\/p>\n Katarina Zimmer es una periodista independiente residente en Nueva York. Encu\u00e9ntrala en Twitter <\/em>@katarinazimmer<\/em>.<\/em> <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" ARRIBA: ISTOCK.COM, TRAFFIC_ANALYZER En menos de una d\u00e9cada desde su adaptaci\u00f3n a una t\u00e9cnica de edici\u00f3n del genoma, se ha utilizado CRISPR-Cas9 en animales de laboratorio y c\u00e9lulas de todo el mundo, as\u00ed como en c\u00e9lulas humanas que ya se est\u00e1n probando en ensayos cl\u00ednicos para tratar enfermedades. 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