ARRIBA: El dispositivo miSHERLOCK brilla intensamente si una muestra de saliva contiene ARN del SARS-CoV-2. INSTITUTO WYSS DE LA UNIVERSIDAD DE HARVARD<\/p>\n
Desde el comienzo de la pandemia de COVID-19, los investigadores se han esforzado por desarrollar pruebas de bajo costo para detectar la presencia de SARS-CoV-2 en muestras de pacientes. Ahora, un equipo de investigadores con sede en el Instituto Wyss de la Universidad de Harvard y el MIT han presentado una plataforma de prueba r\u00e1pida y econ\u00f3mica capaz de distinguir entre las principales variantes del SARS-CoV-2, seg\u00fan un art\u00edculo publicado el viernes (6 de agosto) en Science Advances <\/em>. <\/p>\n La plataforma, llamada miSHERLOCK (pronunciado my-sherlock), es completamente aut\u00f3noma desde la preparaci\u00f3n de la muestra hasta la lectura de la prueba. No requiere equipos o instrumentos externos, y finalmente est\u00e1 destinado a ser construido por el usuario a partir de piezas imprimibles en 3D y componentes electr\u00f3nicos alimentados por bater\u00eda. El equipo estuvo dirigido por el ingeniero biom\u00e9dico James Collins, quien tambi\u00e9n es cofundador y director de Sherlock Biosciences, una empresa creada en torno a la herramienta de diagn\u00f3stico basada en CRISPR llamada SHERLOCK que emplea la plataforma (de ah\u00ed miSHERLOCK: la abreviatura de SHERLOCK m\u00ednimamente instrumentado). <\/p>\n Este dispositivo no es la primera prueba basada en SHERLOCK para detectar el SARS-CoV-2. En mayo pasado, la Administraci\u00f3n de Drogas y Alimentos de EE. UU. otorg\u00f3 una autorizaci\u00f3n de uso de emergencia a una plataforma diferente que emplea la misma tecnolog\u00eda CRISPR para la prueba de COVID-19, y otro ensayo SHERLOCK desarrollado recientemente puede brindar un resultado positivo de COVID similar a una prueba de embarazo. <\/p>\n Sin embargo, esas pruebas a\u00fan requieren pasos externos y equipo de laboratorio para el procesamiento de muestras, mientras que una prueba miSHERLOCK se ejecuta de principio a fin dentro del dispositivo aut\u00f3nomo. La preparaci\u00f3n de muestras sin procesar para el an\u00e1lisis de \u00e1cidos nucleicos requiere varios pasos, incluida la apertura de c\u00e9lulas y part\u00edculas virales para acceder a los \u00e1cidos nucleicos, la extracci\u00f3n de prote\u00ednas y otros componentes celulares de la muestra que podr\u00edan interferir con la reacci\u00f3n, todo mientras se tiene cuidado de no degradar los \u00e1cidos nucleicos; El ARN monocatenario es particularmente sensible a la degradaci\u00f3n.<\/p>\n El trabajo descrito en este documento es realmente innovador, porque combina la [plataforma] sin instrumentos con la detecci\u00f3n CRISPR, dice el ingeniero biom\u00e9dico Changchun de la Universidad de Connecticut Liu, que no particip\u00f3 en el estudio.<\/p>\n La especialista en enfermedades infecciosas del Boston Childrens Hospital y coautora del estudio, Rose Lee, dice que la La motivaci\u00f3n del proyecto miSHERLOCK fue crear una plataforma de pruebas que funcionara en entornos con recursos limitados, incluidas cl\u00ednicas con acceso limitado a equipos de laboratorio y t\u00e9cnicos de laboratorio capacitados, o incluso dentro de la propia casa. Ella dice que al principio de la pandemia, los materiales de prueba convencionales, como hisopos nasales y medios de transporte de muestras, escaseaban. Lee recuerda que el equipo pregunt\u00f3: \u00bfPodr\u00edamos crear un diagn\u00f3stico m\u00e1s simple que permitiera realizar pruebas descentralizadas, especialmente a medida que comienzan a aparecer las variantes? <\/p>\n El resultado fue un ensayo que solo requer\u00eda unos pocos pasos del usuario y ning\u00fan equipo m\u00e1s all\u00e1. lo que se incluye en el aparato de prueba, que cabe en la palma de una mano. La prueba requiere dos mililitros (menos de media cucharadita) de saliva. Despu\u00e9s de que el usuario escupe en el tubo y agrega algunas sustancias qu\u00edmicas, la saliva desciende por una columna en la primera c\u00e1mara de reacci\u00f3n impresa en 3D, que se calienta a 95 C mediante el calentador a bater\u00eda. Las part\u00edculas virales se rompen y los \u00e1cidos nucleicos de la muestra, como el genoma de ARN del virus SARS-CoV-2, se concentran en una membrana especial en la parte inferior de la columna. Luego, el usuario transfiere la columna a la segunda c\u00e1mara impresa en 3D (que funciona a 37 C) y empuja un \u00e9mbolo, colocando la membrana en un tubo nuevo y liberando agua para activar la reacci\u00f3n SHERLOCK de un solo recipiente liofilizado.<\/p>\n El procedimiento de diagn\u00f3stico requiere que un usuario escupa en la c\u00e1mara de preparaci\u00f3n de muestras y luego transfiera el disco de recolecci\u00f3n a la c\u00e1mara de reacci\u00f3n y presione un \u00e9mbolo, lo que activa la reacci\u00f3n y minimiza el riesgo de contaminaci\u00f3n cruzada. Instituto Wyss de la Universidad de Harvard<\/p>\n SHERLOCK, que significa desbloqueo de reportero enzim\u00e1tico espec\u00edfico de alta sensibilidad, implica un par de pasos. Primero, cualquier ARN en la muestra se convierte en ADN. Luego, un paso de amplificaci\u00f3n hace copias de una regi\u00f3n espec\u00edfica de un gen viral. La amplificaci\u00f3n utiliza una enzima en lugar de los ciclos de temperatura tradicionales de PCR para abrir la plantilla de ADN objetivo, lo que significa que toda la reacci\u00f3n se desarrolla a una temperatura constante. Finalmente, una enzima Cas12a unida a un ARN gu\u00eda espec\u00edfico del SARS-CoV-2 escanea el ADN en la mezcla de reacci\u00f3n en busca de la secuencia viral que lo complementa. Si lo encuentra, el ARN gu\u00eda se unir\u00e1 a \u00e9l y Cas12a se activar\u00e1 y comenzar\u00e1 a cortar indiscriminadamente los \u00e1cidos nucleicos que lo rodean, incluida una sonda indicadora que emite una fluorescencia brillante si se corta.<\/p>\n Al final de la reacci\u00f3n en un dispositivo miSHERLOCK, las luces LED dentro de la c\u00e1mara de reacci\u00f3n brillan en la muestra, haciendo que las pruebas positivas brillen intensamente. En el caso de la fluorescencia tenue, los investigadores han desarrollado una aplicaci\u00f3n complementaria para tel\u00e9fonos inteligentes que ayuda a los usuarios a determinar si tienen una prueba positiva y tambi\u00e9n les permite informar instant\u00e1neamente su resultado a los funcionarios locales de salud p\u00fablica. Seg\u00fan el documento, todo el proceso dura aproximadamente una hora, tiene un l\u00edmite de detecci\u00f3n comparable al de las pruebas de PCR aprobadas actualmente y el aparato completo solo cuesta alrededor de $ 15. <\/p>\n Creo que este es uno de los solo ejemplos en los que puede pasar de literalmente ning\u00fan equipo como nada m\u00e1s all\u00e1 de lo que est\u00e1 en el dispositivo en s\u00ed mismo para generar un resultado en el lapso de una hora, dice el gastroenter\u00f3logo del Hospital General de Massachusetts y coautor del estudio Xiao Tan. <\/p>\n Los autores dicen que la idea detr\u00e1s de usar saliva en lugar de hisopos nasofar\u00edngeos m\u00e1s invasivos (y a menudo temidos) era simple, y Liu agrega que la recolecci\u00f3n de saliva no invasiva es ideal para el diagn\u00f3stico en el punto de atenci\u00f3n. Es m\u00e1s conveniente que las muestras de hisopos, dice. <\/p>\n Pero tan f\u00e1cil como escupir en un tubo, extraer \u00e1cidos nucleicos de la saliva es una historia diferente. La saliva es una mezcla compleja, dice Tan, llena de enzimas que b\u00e1sicamente matar\u00e1n cualquier reacci\u00f3n o causar\u00e1n un exceso de falsos positivos porque, al igual que la enzima CRISPR en la prueba, las nucleasas salivales pueden atravesar la sonda indicadora de los ensayos.<\/p>\n Para neutralizar las prote\u00ednas y enzimas que podr\u00edan interferir con el ensayo, la columna de muestra ofrece un doble golpe: un tres- una incubaci\u00f3n de un minuto a 95 C m\u00e1s los productos qu\u00edmicos agregados por el usuario inactivan las enzimas y dejan intacto el ARN viral. En su forma actual, los investigadores tuvieron que agregar los qu\u00edmicos manualmente, pero prev\u00e9n una versi\u00f3n comercial del producto precargado con qu\u00edmicos liofilizados que recubren el interior del tubo y se rehidratan cuando el usuario agrega su saliva. p><\/p>\n Adem\u00e1s de poder probar la infecci\u00f3n general por SARS-CoV-2, la especificidad de Cas12a significa que puede usarse para distinguir entre variantes del pat\u00f3geno. Al cambiar el ARN gu\u00eda Cas12as de detectar una secuencia gen\u00e9rica de SARS-CoV-2 a una que detecta mutaciones espec\u00edficas de variantes, pudieron determinar correctamente qu\u00e9 variante hab\u00edan agregado a las muestras de saliva m\u00e1s del 95 por ciento de las veces, aunque el l\u00edmite de detecci\u00f3n fue diferente de una variante a otra. Los investigadores dise\u00f1aron otra versi\u00f3n de la plataforma de prueba en la que cuatro c\u00e1maras de reacci\u00f3n pueden funcionar una al lado de la otra, cada una de las cuales utiliza diferentes ARN gu\u00eda espec\u00edficos de variante. Aunque admiten que miSHERLOCK no puede reemplazar la secuenciaci\u00f3n tradicional para descubrir nuevas variantes, dicen que esperan que ayude a rastrear la propagaci\u00f3n de variantes en todo el mundo, especialmente en \u00e1reas que no tienen f\u00e1cil acceso a equipos de secuenciaci\u00f3n. <\/p>\n La especificidad es lo que es realmente emocionante, dice la estudiante de posgrado del MIT y coautora Devora Najjar. Cuando hacemos la detecci\u00f3n de variantes, estamos detectando entre SNP dentro de la prote\u00edna espiga, y eso es s\u00faper, s\u00faper, s\u00faper alta resoluci\u00f3n en t\u00e9rminos de lo que est\u00e1s buscando a nivel de \u00e1cido nucleico. Agrega que es raro tener una prueba que sea a la vez tan r\u00e1pida y espec\u00edfica hasta el nivel de un solo par de bases.<\/p>\n El Los investigadores dicen que su objetivo es hacer que toda la plataforma de prueba sea lo suficientemente barata y f\u00e1cil para que cualquier persona pueda ensamblarla de principio a fin y eliminar pasos que normalmente requieren equipos como pipetas o termocicladores, pero miSHERLOCK no est\u00e1 listo para implementarse en pacientes confinados en el hogar. o m\u00e9dicos remotos todav\u00eda. Lee dice que la iteraci\u00f3n actual del prototipo estaba destinada a la publicaci\u00f3n acad\u00e9mica, no al uso en el hogar, y agrega que, si bien los planos imprimibles en 3D para las c\u00e1maras de reacci\u00f3n est\u00e1n disponibles gratuitamente, el prototipo actual a\u00fan requiere bastante montaje<\/p <\/p>\n Creo que ser\u00eda realmente incre\u00edble si una persona pudiera imprimir en 3D esta prueba en su propia casa, obtener algunos componentes, ensamblarlos ellos mismos como si fueran muebles de IKEA y luego simplemente comprar los [componentes] que pueden usar, dice Helena de Puig, postdoctorado en Wyss y coautor. Alternativamente, dice, los usuarios podr\u00edan comprar las piezas impresas en 3D y ensamblarlas, o incluso comprar el dispositivo completamente ensamblado. En cualquier caso, los usuarios tendr\u00edan que comprar kits que contengan los componentes de la reacci\u00f3n de SHERLOCK liofilizados y partes de la prueba que solo se pueden usar una vez, como la membrana de captura de ARN o el \u00e9mbolo. Tan dice que prev\u00e9n que los componentes de la reacci\u00f3n de SHERLOCK, que incluyen el Cas12a espec\u00edfico del pat\u00f3geno, sean tan f\u00e1ciles de cambiar como los diferentes sabores de las bolsitas de caf\u00e9 instant\u00e1neo. <\/p>\n Los cuatro primeros autores del art\u00edculo de miSHERLOCK, en la foto de derecha a izquierda: Devora Najjar, Rose A. Lee, Helena de Puig y Xiao TanWYSS INSTITUTE AT HARVARD UNIVERSITY<\/p>\n Adem\u00e1s del hardware que debe ajustarse para la fabricaci\u00f3n comercial, el ensayo en s\u00ed deber\u00e1 someterse a pruebas y aprobaci\u00f3n completas por parte de la FDA antes de que pueda ser lanzado al p\u00fablico en general. Una limitaci\u00f3n importante del estudio actual es que miSHERLOCK solo se prob\u00f3 en 27 muestras cl\u00ednicas, se\u00f1ala Jonathan Parr, m\u00e9dico de enfermedades infecciosas y epidemi\u00f3logo molecular de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, en un correo electr\u00f3nico a The Scientist<\/em>. Parr desarrolla diagn\u00f3sticos basados en CRISPR para la malaria, pero no particip\u00f3 en el estudio actual. Los donantes de muestra fueron todos pacientes de COVID-19 de Rep\u00fablica Dominicana y ninguno estaba infectado con variantes preocupantes, agrega. Si bien los autores reconocen la escasez de muestras cl\u00ednicas en su art\u00edculo, Parr dice que, no obstante, plantea preocupaciones sobre el rendimiento real de su ensayo.<\/p>\n En el art\u00edculo, los investigadores explicaron que hab\u00eda pocas muestras disponibles para analizar porque Las muestras de saliva no se han recolectado de forma rutinaria para las pruebas de SARS-CoV-2. Tuvieron que arregl\u00e1rselas con lo que ten\u00edan, raz\u00f3n por la cual sus pruebas de especificidad se realizaron en muestras de saliva disponibles en el mercado (pero no infectadas) que estaban enriquecidas con diferentes variantes, y no incluyeron pruebas en la variante Delta ahora dominante. Najjar se\u00f1ala que Delta simplemente no era una variante de preocupaci\u00f3n cuando estaban desarrollando la plataforma hace unos meses, pero agrega que la velocidad con la que Delta se ha extendido es un testimonio de la necesidad de plataformas de prueba flexibles como miSHERLOCK. Las variantes que importan un mes pueden ser completamente irrelevantes al siguiente, dice.<\/p>\n Con suerte, m\u00e1s temprano que tarde, ya no habr\u00e1 una necesidad de plataformas de prueba de coronavirus f\u00e1ciles de usar, pero los investigadores dicen que miSHERLOCK no comenzar\u00e1 a acumular polvo cuando llegue ese momento. El principio del dispositivo se puede utilizar para muchas cosas diferentes, dice de Puig. Si solo cambiamos el ARN gu\u00eda y algunos componentes, podemos diagnosticar diferentes infecciones. Siempre que haya material de \u00e1cido nucleico, dice, se puede construir un ensayo a su alrededor. <\/p>\n Los investigadores dicen que tambi\u00e9n est\u00e1n pensando en modificar el ensayo para poder procesar diferentes tipos de muestras, incluyendo sangre y orina. Lee dice que ya est\u00e1 trabajando con de Puig y Najjar en la adaptaci\u00f3n de miSHERLOCK para diagnosticar la enfermedad febril tropical aguda. Est\u00e1n pensando en tener un dispositivo multiplex que pueda distinguir entre la malaria, el \u00e9bola, el dengue, este tipo de cosas que en realidad son cl\u00ednicamente muy dif\u00edciles de distinguir, dice, mediante el uso de este tipo de dispositivo multiplex descentralizado, f\u00e1cil de distribuir y de bajo costo en entornos que pueden no tienen acceso a formas m\u00e1s tradicionales de pruebas de laboratorio cl\u00ednico.<\/p>\n El desarrollo de un ensayo SARS-CoV-2 no es novedoso en s\u00ed mismo, escribe Parr, y se\u00f1ala el hecho de que m\u00faltiples SARS-CoV basados en CRISPR Se han desarrollado dos pruebas y hay un n\u00famero creciente de ensayos basados en CRISPR que pueden identificar cepas y mutaciones de pat\u00f3genos espec\u00edficos. Lo importante de este art\u00edculo, dice, es que los autores trabajaron arduamente para que su ensayo fuera simple y f\u00e1cil de usar, desde la preparaci\u00f3n de la muestra hasta la lectura final.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" ARRIBA: El dispositivo miSHERLOCK brilla intensamente si una muestra de saliva contiene ARN del SARS-CoV-2. INSTITUTO WYSS DE LA UNIVERSIDAD DE HARVARD Desde el comienzo de la pandemia de COVID-19, los investigadores se han esforzado por desarrollar pruebas de bajo costo para detectar la presencia de SARS-CoV-2 en muestras de pacientes. 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