Regeneración tisular controlada con patrones de factores de crecimiento definidos espaciotemporalmente bioimpresos en 3-D
Infiltración de vasos mejorada y angiogénesis debido a un gradiente distinto de VEGF. (A) Esquema del andamio impreso en 3D y grupos experimentales. Diseño de construcción (4 mm de diámetro, 5 mm de altura). Secciones teñidas con H&E de los tres grupos experimentales en (B) 2 y (C) 4 semanas in vivo. Las imágenes se tomaron a las 20. Las flechas indican los vasos. (D) Número total de vasos de los grupos experimentales a las 2 y 4 semanas in vivo. Número de vasos presentes en el centro frente a la periferia en (E) 2 y (F) 4 semanas in vivo. **P < 0.01. Las barras de error indican SD (n = 8 animales, n = 5 rebanadas por animal). FBS, suero bovino fetal; pluma/estreptococo, penicilina/estreptomicina. Crédito: Science Advances, doi:10.1126/sciadv.abb5093
Un equipo de investigadores de ingeniería biomédica, ingeniería mecánica y biomecánica de Irlanda, los Países Bajos y los EE. UU. desarrolló recientemente implantes bioimpresos en 3D optimizados con factores de crecimiento para facilitar la angiogénesis de los vasos sanguíneos crecimiento a partir de vasculatura existente y osteogénesis crecimiento de hueso nuevo. En este trabajo, Fiona E. Freeman y sus colegas funcionalizaron biotintas con nanopartículas para imprimir implantes con distintos patrones de factores de crecimiento y notaron cómo la tasa de crecimiento de vasos sanguíneos in vivo (angiogénesis) dependía de la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). ). Observaron niveles más altos de invasión de los vasos en los implantes que contenían un gradiente de VEGF en comparación con los que estaban cargados homogéneamente con cantidades similares de la proteína. Los implantes impresos mantuvieron un gradiente de VEGF junto con una cinética de liberación y localización de proteína morfogenética ósea (BMP) espacialmente definida para acelerar la cicatrización de grandes defectos óseos junto con una mínima formación de hueso heterotópico, es decir, un crecimiento óseo anormal en tejido no óseo. El trabajo tiene potencial para bioimprimir factores de crecimiento para la terapia en el punto de atención y en aplicaciones biomédicas de regeneración de tejidos estrictamente controlada.
Factores de crecimiento para aplicaciones terapéuticas
Los investigadores han probado varios factores de crecimiento en ensayos clínicos para diversas aplicaciones terapéuticas, incluida la regeneración ósea y la formación de nuevos vasos sanguíneos o la neovascularización. A pesar de los resultados prometedores, algunos resultados en los ensayos de fase dos no han mostrado los beneficios esperados para los pacientes y algunos incluso han demostrado efectos adversos marcados. Los factores de crecimiento generalmente se expresan durante diferentes fases de la curación de la fractura, incluido el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y la proteína morfogenética ósea (BMP). Para obtener resultados óptimos, los científicos han desarrollado terapias combinadas de los dos factores de crecimiento (VEGF y BMP) para acelerar la regeneración de grandes defectos óseos. Durante la curación de la fractura, los niveles de expresión de BMP-2 suelen aumentar constantemente hasta el día 21, mientras que la expresión de VEGF alcanza su punto máximo antes. Por lo tanto, desarrollaron sistemas de administración que apoyaron la liberación temprana de VEGF y la liberación sostenida de BMP-2. En este trabajo, Freeman et al. utilizó técnicas de biofabricación de herramientas múltiples para administrar VEGF y BMP-2 con distintos perfiles de liberación para mejorar la regeneración de defectos óseos de tamaño crítico.
La administración temporal localizada de BMP-2 condujo a una formación ósea controlada. (A) Esquema de los grupos experimentales. Diseño de construcción (4 mm de diámetro, 5 mm de altura). MEM, medio esencial mínimo alfa. (B) Degradación de los dos bioinks. (C) Liberación acumulativa de BMP-2 de la biotinta de liberación rápida frente a la biotinta de liberación lenta. (D) reconstrucciones 3D de los datos de TC para cada grupo a las 8 semanas. (E) Análisis de TC sobre la deposición mineral total de cada uno de los grupos después de 8 semanas in vivo. (F) Análisis de TC sobre la ubicación de la deposición mineral de cada uno de los grupos después de 8 semanas in vivo. ***P < 0,001; las barras de error indican SD (n = 8 animales). (G) Secciones teñidas con tricromía de Goldner de ambos grupos después de 8 semanas in vivo. Las imágenes se tomaron a los 20. Las flechas blancas indican tejido óseo en desarrollo y las flechas negras indican vasos sanguíneos. (H) Cuantificación de la cantidad de formación de hueso nuevo por área total. Las barras de error denotan SD; **P < 0,01 (n = 8 animales, n = 6 rebanadas por animal). Crédito: Science Advances, doi:10.1126/sciadv.abb5093 Desarrollo de biotintas con distintos perfiles de liberación de factores de crecimiento para la implantación in vivo
El equipo controló la liberación de morfógenos (factores de crecimiento) a partir de construcciones impresas en 3D, que desarrollaron con biotintas a base de alginato con diferentes nanopartículas incrustadas para unirse a los factores reguladores. Disminuyeron la liberación de BMP-2 en las construcciones para mejorar la formación ósea in vivo en ubicaciones predefinidas del implante para acelerar la cicatrización ósea y minimizar la formación ósea ectópica. Freeman et al. nanopartículas de arcilla usadas o nanopartículas de hidroxiapatita en el bioink hecho de alginato-metilcelulosa para facilitar la liberación controlada de VEGF. Mostraron cómo las construcciones mantuvieron los gradientes espaciales de los factores de crecimiento durante al menos 14 días en el laboratorio después de la bioimpresión.
Las construcciones de VEGF impresas mejoraron la angiogénesis in vivo, que el equipo probó depositando las construcciones en implantes de policaprolactona (PCL) impresos en 3D para acelerar la vascularización en un modelo de ratón. Dos semanas después de la implantación subcutánea dentro del modelo animal, realizaron análisis histológicos para revelar la presencia de vasos en grupos VEGF homogéneos y en gradiente. No había vasos evidentes presentes en el grupo sin VEGF. Entre dos y cuatro semanas, los grupos de gradiente VEGF tenían vasos significativamente más altos en las limitaciones de la periferia, Freeman et al. observó que el crecimiento de los vasos en las construcciones era maduro y completo.
La administración espaciotemporal de VEGF y BMP-2 condujo a una angiogénesis mejorada. (A) Esquema de los grupos experimentales impresos en 3D, incluidas las características clave de los biotintas desarrollados y el procedimiento de defecto segmentario. Diseño de construcción (4 mm de diámetro, 5 mm de altura). (B) Imágenes representativas de angiografía por TC del diámetro del vaso. Las flechas rojas indican vasos sanguíneos con fugas indicados por charcos de agente de contraste. Cuantificación de (C) volumen total del vaso, (D) diámetro medio del vaso y (E) conectividad para todos los grupos después de 2 semanas in vivo. *P < 0,05 y **P < 0,01; las barras de error indican SD (n = 9 animales). (F) Tinción inmunohistoquímica de núcleos (azul), vWF (rojo) y SMA (verde) de los grupos experimentales 2 semanas después de la implantación. Se tomaron imágenes a 40 y 63. Las flechas amarillas indican vasos con tinción dual de SMA y vWF; las flechas blancas indican vasos ligeramente menos maduros con solo tinción positiva de vWF. Crédito: Science Advances, doi:10.1126/sciadv.abb5093 Administración de BMP-2 para localizar la formación ósea in vivo
Dado que se sabe que la liberación lenta y sostenida de BMP-2 contribuye a una regeneración ósea óptima, el equipo realizó estudios de formación ósea en un modelo de ratón con liberación de factor de crecimiento dentro de un marco de tiempo distinto. Para reducir notablemente la liberación de BMP-2 del bioink, Freeman et al. agregó laponita (una plataforma de nanomedicina) y monitoreó su liberación constante de una a cuatro semanas en el laboratorio. Luego, para comprender los efectos sobre la formación ósea (osteogénesis) en un modelo animal, los científicos construyeron biotintas para una liberación rápida de BMP-2 (sin laponita) y una liberación lenta de BMP-2 (con laponita) y mezclaron las biotintas con mesenquimales derivados de la médula ósea. células madre (BMSC) y las depositaron dentro de andamios impresos en 3D. Luego implantaron estos andamios por vía subcutánea en la espalda de los ratones y siguieron el proceso mediante la siembra de células madre mesenquimales adicionales para evaluar el crecimiento óseo en una ubicación ectópica. Los estudios de cuantificación mostraron la liberación lenta de BMP-2 para una formación significativamente mayor de hueso nuevo por área total de la construcción. El trabajo también demostró que la liberación lenta de BMP-2 tiene un potencial de formación de hueso significativamente mayor por área total de la construcción.
La administración temporal de BMP-2 exógena induce la curación ósea temprana a través de un proceso de osificación endocondral. (A) Secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) y safranina de todos los grupos después de 2 semanas in vivo. Las imágenes se tomaron en 20. DB indica cartílago que se somete a osificación endocondral para convertirse en hueso en desarrollo, y B indica tejido óseo nuevo positivo. Cuantificación de la cantidad de (B) formación ósea y (C) hueso en desarrollo por área total. Las barras de error indican SD (n = 9 animales). (D) Imágenes reconstruidas por TC del sitio del defecto. Crédito: Science Advances, doi:10.1126/sciadv.abb5093
Mejora de la angiogénesis en defectos óseos grandes
Freeman et al. next demostró la entrega espaciotemporal de factores de crecimiento (VEGF y BMP-2) para mejorar la angiogénesis. Usando construcciones de BMP-2 de liberación retardada que contenían gradientes espaciales en VEGF, registraron una formación ósea mejorada y un crecimiento de vasos sanguíneos dentro de defectos óseos femorales de rata de tamaño crítico. Dos semanas después de la implantación, los angiogramas de microtomografía computarizada (micro-CT) mostraron la aparición de redes vasculares en todos los grupos experimentales utilizados en el estudio, junto con vasos sanguíneos inmaduros primitivos con diferencias notables entre diferentes construcciones experimentales. Dos semanas después de la cirugía, también notaron una tinción positiva para cartílago y hueso nuevo en los grupos experimentales compuestos y con gradiente de BMP-2. Cuando realizaron pruebas de microCT para comprender la formación ósea, notaron patrones de curación consistentes. Los mapas comparativos de densidad ósea obtenidos dentro de las 12 semanas posteriores a la implantación revelaron que los nuevos huesos contenían hueso similar a la cortical comparable al hueso nativo adyacente. Para investigar la formación de hueso heterotópico, los científicos realizaron un análisis del volumen óseo en una región de interés en la semana 12 de la reconstrucción, donde el hueso se formó preferentemente en el anillo del defecto con poca formación de hueso ectópico en todos los grupos experimentales. La tinción histológica adicional reveló la formación predominante de tejido fibroso, médula ósea y cartílago.
La administración espaciotemporal de VEGF y BMP-2 condujo a una mejor distribución del tejido óseo 12 semanas después de la implantación del andamio. (A) Análisis de TC in vivo reconstruido de la formación ósea en los defectos. (B) Cuantificación del volumen óseo total (mm3) en los defectos en cada momento. (C) Imágenes representativas de las densidades óseas de CT en los defectos a las 12 semanas a la mitad del defecto (barra de escala, 1 mm en todo). (D) Densidad ósea promedio (mg HA/cm3) en los defectos en cada punto de tiempo. (E) Resumen del análisis del volumen óseo de la ROI, incluidas las definiciones de las regiones central, anular y heterotópica. (F) Volumen óseo total (mm3) en cada región a las 12 semanas. **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001; las barras de error indican SD (n = 9 animales). Crédito: Science Advances, doi:10.1126/sciadv.abb5093
De esta manera, Fiona E. Freeman y sus colegas desarrollaron implantes impresos en 3D con factores de crecimiento, que incluían de manera óptima gradientes espaciales de VEGF acoplado a BMP-2 para mejorar grandes cicatrización del defecto óseo con poca formación de hueso heterotópico (anormal). El equipo logró una mayor respuesta de cicatrización ósea utilizando concentraciones muy bajas de factores de crecimiento exógenos. El próximo paso incluirá la traducción de tales tecnologías de ingeniería de tejidos desde el banco hasta la cabecera, lo cual es un proceso desafiante, costoso y lento. El enfoque detallado en este trabajo es una estrategia sin precedentes que permite la administración del factor de crecimiento espaciotemporal para regenerar defectos óseos grandes o aumentar la vascularización de cualquier construcción impresa en 3D. El equipo prevé futuras aplicaciones de esta tecnología para la regeneración controlada de diversos tipos de tejidos.
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Recrecimiento óseo utilizando un sustituto cerámico y factores de crecimiento derivados de E. coli Más información: Fiona E. Freeman et al. Patrones de factores de crecimiento definidos espaciotemporalmente por bioimpresión en 3D para controlar estrictamente la regeneración de tejidos, Science Advances (2020). DOI: 10.1126/sciadv.abb5093
Michael Simons et al. Angiogénesis terapéutica en enfermedades cardiovasculares, Nature Reviews Drug Discovery (2003). DOI: 10.1038/nrd1226
Zarana S. Patel et al. Suministro dual de un factor de crecimiento angiogénico y osteogénico para la regeneración ósea en un modelo de defecto de tamaño crítico, Bone (2008). DOI: 10.1016/j.bone.2008.06.019 Información de la revista: Science Advances , Nature Reviews Drug Discovery , Bone