Cuando los dedos de zinc no dan en el blanco
Dedos de zinc unidos al ADNWIKIMEDIA COMMONS, THOMAS SPLETTSTOESSER
Las nucleasas de dedos de zinc están diseñadas para ser como misiles buscadores de calor, dirigidos con precisión para encontrar y cortar secuencias específicas de ADN. De vez en cuando, sin embargo, pueden cortar en el lugar equivocado, provocando roturas no deseadas. Dos artículos publicados hoy (7 de agosto) en revistas de Nature describen formas de encontrar sistemáticamente tales acciones fuera del objetivo, que algún día podrían ayudar a diseñar terapias génicas que eviten daños colaterales.
&ldquo ;Hasta este momento, no ha habido una forma realmente completa de definir la especificidad de la nucleasa con dedos de zinc” dijo Carlos Barbas, biólogo químico del Instituto de Investigación Scripps en La Jolla, California, que no participó en el estudio. «A medida que comenzamos a tratar pacientes con nucleasas con dedos de zinc y modificar genomas, necesitamos saber dónde se están realizando esas modificaciones».
Dedos de zinc, llamados así porque su estructura se asemeja a una mano con una punta dedo, se unen a diferentes nucleótidos de tres letras…
Pero no es un sistema perfecto: a veces la molécula puede unirse y cortar una secuencia de ADN diferente, casi idéntica, potencialmente matando células.
Para caracterizar sistemáticamente esos sitios de escisión fuera del objetivo, el biólogo químico de Harvard David Liu y sus colegas probaron dos ZFN en una biblioteca de 100 mil millones de fragmentos de ADN, algunos de los cuales aparecen en el genoma humano. La mayoría de las veces, las nucleasas escindieron el sitio objetivo. Pero ocasionalmente también cortaron otras secuencias similares, incluido un gen asociado con una vía de señalización del cáncer.
Una interpretación superficial de nuestro artículo podría llevar a uno a ser pesimista sobre las nucleasas con dedos de zinc, pero en realidad soy optimista, dijo Liu. Además de confirmar que la cantidad de rupturas fuera del objetivo disminuyó con concentraciones más bajas de ZFN, los investigadores encontraron que el uso de ZFN que se unen con menos avidez a la secuencia objetivo parecía tener menos interrupciones no intencionales, dijo. Eso sugiere que puede ser posible diseñar terapias ZFN de una manera que minimice esos efectos fuera del objetivo. Los investigadores publicaron sus resultados en Nature Methods.
En el segundo estudio, publicado en Nature Biotechnology, los investigadores dosificaron células de leucemia humana con un ZFN que corta el receptor CCR-5. Identificaron las ubicaciones de corte al transfectar las células con partículas de virus etiquetadas que se unían a los extremos rotos del ADN y descubrieron que, en general, el ZFN se unía al ADN CCR-5 objetivo. Sin embargo, aproximadamente 1 de cada 20.000 veces, escindió un segundo gen del receptor en una secuencia casi idéntica, así como algunas otras secuencias similares incluso más raramente. Pero los investigadores usaron una concentración extremadamente alta de ZFN, y usaron una línea celular que es muy permisiva con la acción de ZFN, para ver cuál sería el peor de los casos, dijo el coautor Phillip Gregory, director científico de Sangamo BioSciences. La baja tasa de cortes fuera del objetivo, incluso en estas condiciones, valida nuestras expectativas de que las proteínas serían tremendamente específicas, y sugiere que casi nunca se esperaría que dosis médicas mucho más bajas aplicadas en la clínica causaran cortes fuera del objetivo, dijo.
Los métodos podrían usarse algún día en el desarrollo temprano de fármacos para elegir candidatos con la mejor especificidad, dijo Barbas. Sin embargo, no está claro qué tan completas son las nuevas pruebas ZFN, dijo. El método de partículas de virus etiquetadas, por ejemplo, puede pasar por alto alguna escisión fuera del objetivo, porque las etiquetas virales pueden no unirse a cada ruptura. Además, agregó Barbas, a diferencia del ADN en un tubo de ensayo, el ADN celular está fuertemente enrollado en la cromatina, por lo que muchos de los sitios de unión encontrados por el método del tubo de ensayo podrían protegerse de los ZFN y nunca cortarse en las células vivas.
Entonces, si bien las nuevas pruebas pueden ser herramientas clave para el desarrollo temprano de fármacos, solo se obtendrá una imagen completa una vez que se pueda obtener la secuencia completa del genoma de una persona por $ 1000, dijo, cuando los investigadores puedan evaluar a las personas que reciben tratamientos ZFN para cada off- rotura de objetivo.
R. Gabriel, et. al, Un análisis imparcial de todo el genoma de la especificidad de la nucleasa de dedo de zinc, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.1948, 2011.
V . Pattanayak, et. al, Revelación de las especificidades de escisión fuera del objetivo de las nucleasas con dedos de zinc mediante selección in vitro, Nature Methods, doi:10.1038/nmeth.1670, 2011.
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