Próxima generación: Cientos de análisis celulares a la vez

El chip microfluídico RT-qPCR de una sola célulaCARL HANSEN

EL DISPOSITIVO: Como una máquina de pinball, el diminuto Las palancas estacionarias dentro de este nuevo chip de microfluidos dirigen las células a compartimentos lo suficientemente grandes como para que quepa una célula. Con 300 compartimentos por chip (un número que podría escalarse fácilmente a 1000 o más), cada célula se lava y luego se lisa, y su contenido se canaliza a un nuevo compartimento donde comienza la PCR cuantitativa en tiempo real, leyendo el ADN a medida que se procesa. ;s amplificado. La medición de muchas células individuales a la vez permite al investigador distinguir las diferencias individuales entre las células a medida que reaccionan a los cambios ambientales, o observar los cambios genéticos en la composición de células mixtas de un tumor. Más adelante, el chip también podría tener aplicaciones clínicas y de diagnóstico.

Las células fluyen hacia cámaras de captura individuales, donde se lavan y lisan, antes de introducirse en la reacción de RT PCR. CORTESÍA DE ADAM WHITE, UNIVERSIDAD DE BRITÁNICA. ..

NOVEDADES: Aunque los investigadores habían demostrado anteriormente que es posible amplificar genes mediante PCR a partir de células individuales, el proceso era laborioso y limitaba el número de células que podían analizarse a la vez. Carl Hansen y sus colegas de la Universidad de Columbia Británica en Vancouver diseñaron un chip que supera estas limitaciones al agilizar el «movimiento de las células hacia un bolsillo de captura», dijo Samuel Kim, investigador postdoctoral de la Universidad de Stanford que no participó en la investigación. palancas enfocan el flujo de la suspensión de celdas en cada cámara de celdas, y debido a que los bolsillos son lo suficientemente grandes como para caber en una celda, la siguiente celda simplemente pasa y hace ping en la siguiente cámara vacía. Con una eficiencia de casi el 100 por ciento, «garantiza captura de una sola célula por cámara», dijo Kim, quien estudia microfluídica en el laboratorio de Richard Zare en Stanford.

Pero determinar el tamaño correcto para las cámaras no fue una tarea sencilla. El tamaño tenía que ser el correcto, no solo para capturar la mayoría de los tipos de células (las células inusualmente grandes o pequeñas no caben), sino también para crear la proporción correcta de materia celular a reactivos de PCR. Mientras que una proporción más alta de material de partida a reactivo es mejor para mejorar la precisión de detección, cuando se trabaja con volúmenes de picolitros, si «la concentración de la célula es demasiado alta», dijo Hansen, «envenena la reacción».

Otro beneficio del chip es que «muy bien hace posible limpiar las células», dijo Kim. Antes de ser lisadas y canalizadas a la reacción de PCR, las células deben limpiarse para garantizar que solo se amplifique el ADN o el ARN de la célula capturada, en lugar del ADN residual de otras fuentes. El nuevo chip incorpora convenientemente este paso en sus procesos.

Primer plano de una cámara de PCR de RT y captura de células ADAM WHITE

IMPORTANCIA: «Todo esto se deriva de un problema general en la investigación biológica ”, dijo Hansen. “La mayoría de las tecnologías existentes se han limitado al análisis de mezclas de células”, porque se necesitan mayores cantidades de material de partida para la detección. El inconveniente de estudiar los mecanismos celulares por agregado es que incluso las células con los mismos genomas pueden tener diferentes reacciones ante los mismos estímulos. En lugar de detectar estas diferencias sutiles, las mediciones agregadas solo detectan la respuesta promedio o más prevalente.

Hansen y sus colaboradores ya han utilizado el chip para leer la expresión de microARN en una variedad de tipos de células, incluida una línea celular. derivados de leucemia y en células madre embrionarias durante la diferenciación. También usaron el chip para identificar variantes de un solo nucleótido en un gen que se sospecha altera el potencial metastásico de una muestra de paciente con cáncer de mama.

Aunque el uso más obvio de esta tecnología es en la investigación básica, los médicos también podrían encontrar tal chip útil, dijo Hansen. Aunque ninguna investigación ha demostrado que las mediciones de células individuales puedan mejorar el diagnóstico de una enfermedad, dijo, detectar mutaciones en una mezcla heterogénea de células tumorales, algunas de las cuales pueden conferir resistencia a los medicamentos, podría ayudar a los médicos a decidir cómo tratar el cáncer.  Actualmente, Hansen está colaborando con Fluidigm Corporation, que desarrolla y vende chips microfluídicos para una serie de aplicaciones, para seguir desarrollando el chip.

NECESITA MEJORAR: Si bien el chip brinda investigadores una nueva forma de estudiar un gran número de células individuales, actualmente sólo puede detectar uno o dos genes por célula, dijo Hansen. La medición de 10 o más genes usando PCR multiplex podría dar al investigador una mejor idea de la firma genética individual de una célula.

Además, el chip actual usa PCR en tiempo real, que incorpora nucleótidos marcados con fluorescencia después de cada ciclo de replicación de PCR, que requieren un lector óptico grande y sensible  «El siguiente paso obvio sería deshacerse de la detección de fluorescencia (pasar a la detección electrónica) para que sea más barata y portátil», dijo Albert Folch, de la Universidad de Washington, que no participó en la investigación. un correo electrónico, reemplazando la detección de fluorescencia con un chip de microarray de lectura electrónica, por ejemplo.

Debido a que Fluidigm está explorando la innovación como un producto potencial, no se ha fijado un precio. Pero en cuanto al costo de los reactivos, Hansen dijo que costaría lo mismo ejecutar un chip completo de 300 células que hacer un análisis de una sola célula en un tubo.

AK White et al., «RT-qPCR unicelular microfluídica de alto rendimiento», PNAS,  doi: 10.1073/pnas.1019446108, 2011.

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