Kits de extracción de ADN contaminados
FLICKR, CIMMYTLos investigadores que estudian los microbiomas pueden hacer todo lo posible para prevenir la contaminación, pero un nuevo estudio revela una contaminación generalizada y de bajo nivel en los kits de extracción de ADN. En un informe de BMC Biology de hoy (11 de noviembre), Alan Walker de la Universidad de Aberdeen en el Reino Unido y sus colegas enumeran docenas de taxones contaminantes que pueden inundar la verdadera señal microbiana de una muestra, si las concentraciones iniciales son bajo.
“Es realmente importante secuenciar un control de extracción negativo” dijo Patrick Schloss, investigador de microbiomas de la Universidad de Michigan que no participó en este estudio. «Eso es algo que la gente debería estar haciendo y no está haciendo».
¿Contaminación o señal?
La presencia de ADN microbiano en reactivos de laboratorio no es nada nuevo Los estudios incluso han encontrado ADN bacteriano en agua ultrapura, y hace solo unas semanas los investigadores señalaron una contaminación ubicua en las secuencias de próxima generación. En muchos casos, este ADN extraño puede no ser un problema…
El grupo de Walkers realizó diluciones en serie de Salmonella bongori, comenzando con 100 millones de células y reduciendo la muestra a 1000. células. Cuando la muestra de S. bongori tenía 10 000 células o menos, la abundancia de ADN de otros taxones microbianos excedía el 50 por ciento de las secuencias. Esto sucedió usando cuatro kits de extracción comerciales diferentes. Bradyrhizobiaceae, Burkholderiaceae, Pseudomonadaceae y docenas de otros grupos bacterianos estaban presentes, aunque cada kit tenía un perfil diferente.
Se suponía que eran estériles, dijo Walker, y agregó que, para ser justos, la extracción de ADN Los kits no se comercializan como tales. Lo que [los investigadores] deben hacer es regresar y hacer algunos controles negativos y, con un poco de confianza, decir que realmente están en las muestras, en los casos en que tal vez haya resultados potencialmente sospechosos, dijo. Schloss señaló que los investigadores no deben confiar en la lista que produjo el equipo de Walkers como un catálogo completo de posibles contaminantes, sino asegurarse de hacer sus propios controles dado que la contaminación puede variar de un lote a otro.
Protección de muestras
El artículo de Walkers señaló un par de estudios en los que las enfermedades humanas se han relacionado con microbios inesperados. En uno, por ejemplo, Delphine Lee del John Wayne Cancer Institute en Santa Mónica, California, y sus colegas encontraron diferentes perfiles microbianos en tejido mamario de pacientes con cáncer y controles normales, a saber, diferentes cantidades de Methylobacterium radiotolerans y Sphingomonas yanoikuyae. Aunque Metilobacteriaceae y Shingomonadaceae aparecieron en algunos de los kits de extracción de ADN que probó el grupo Walkers, Lee dijo que ella y su equipo son muy conscientes de los problemas de contaminación, especialmente dado que su trabajo involucra muestras de baja biomasa y que realizaron los controles correctos.
Con una biomasa baja se puede detectar el más mínimo cambio, dijo Lee a The Scientist. Por el contrario, una muestra fecal tendría muchas más células microbianas. Podría estornudar encima, no afectará los hallazgos.
Otro estudio, realizado por Matthew Meyerson de la Escuela de Medicina de Harvard y colegas, identificó una nueva especie bacteriana, Bradyrhizobium enterica, en pacientes con un síndrome de colitis. Bradyrhizobium también se detectaron en el estudio de Walkers, aunque Meyerson dijo que su equipo no detectó ningún ADN del organismo en los reactivos utilizados. Además, su grupo realizó una hibridación in situ en las muestras, a partir de la cual pudieron ver una señal de B. enterica en tejidos de pacientes con colitis pero no en controles. Meyerson dijo que la contaminación siempre es una posibilidad, y la realización de ensayos celulares adicionales agrega una capa muy fuerte de confianza en los resultados de secuenciación.
Schloss ha experimentado sus propios problemas con la contaminación de reactivos. En un estudio sobre fibrosis quística, su equipo encontró ADN de Pseudomonas presente en un kit comercial. Tal contaminación es particularmente problemática dado que estas bacterias son un patógeno importante en el pulmón, especialmente entre las personas con fibrosis quística. Necesitamos ser cuidadosos en la forma en que diseñamos nuestros experimentos [y determinamos] qué tipos de controles son críticos.
Kits limpios
Martin Laurence, el fundador de ShipShaw Labs, con sede en Montreal, que desarrolla herramientas bioinformáticas, dijo que los estudios de secuenciación se beneficiarían enormemente de los kits que no contienen ADN microbiano. Eso simplificaría mucho los estudios, dijo Laurence, quien informó con colegas a principios de este año sobre la presencia de ADN bacteriano en las lecturas de secuenciación del genoma humano.
En un correo electrónico a The Scientist , el portavoz de Qiagen, Przemek Jedrysik señaló que el QIAamp DNA Stool Mini Kit, uno de los cuatro probados por Walker, no fue diseñado para estar libre de ADN o para usarse en aplicaciones de baja biomasa. Sin embargo, agregó, Qiagen reconoce que ciertos análisis requieren reactivos más limpios y la compañía ha estado desarrollando productos con columnas de centrifugado de productos ultra limpios (UCP). Los laboratorios independientes han confirmado que los nuevos kits UCP tienen un fondo significativamente más bajo y, por lo tanto, cumplen con los requisitos para los análisis de alta sensibilidad.
No son solo los investigadores y los fabricantes de kits los que tienen la responsabilidad de gestionar los problemas de contaminación, sino también los pares. revisores también, dijo Laurence. En el futuro, este artículo debería hacer que el proceso de revisión por pares sea más estricto para los artículos que encuentran errores nuevos y los asocian con enfermedades humanas. En particular, eso significa garantizar que los estudios incluyan los controles apropiados. Muchos, muchos estudios han usado estos kits de extracción de ADN, dijo. Estoy muy sorprendido de que alguien haya tardado tanto en informar sobre la contaminación.
SJ Salter et al., La contaminación de reactivos y laboratorios puede tener un impacto crítico en los análisis de microbiomas basados en secuencias, BMC Biology , 12:87, 2014.
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