Avances en la edición del genoma
Ilustración de la ADN ligasa, una de las proteínas celulares implicadas en la reparación de roturas de doble cadena en DNAWIKIMEDIA; ESCUELA DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE WASHINGTON EN ST. LOUIS, TOM ELLENBERGERLa mayoría de las enfermedades genéticas en humanos son causadas por mutaciones puntuales: errores de una sola base en la secuencia de ADN. Sin embargo, los métodos actuales de edición del genoma no pueden corregir de manera eficiente estas mutaciones en las células y, a menudo, provocan inserciones o eliminaciones aleatorias de nucleótidos (indels) como subproducto. Ahora, los investigadores de la Universidad de Harvard han modificado la tecnología CRISPR/Cas9 para sortear estos problemas, creando un nuevo «editor base» descrito hoy (20 de abril) en Nature, que convierte de manera permanente y eficiente la citosina (C) en bases de uracilo (U) con un bajo error en líneas celulares humanas y de ratón.
“Hay muchas enfermedades genéticas en las que, en esencia, desearía intercambiar bases dentro y fuera” dijo Jacob Corn, director científico de la Iniciativa de Genómica Innovadora de la Universidad de California, Berkeley, quien fue…
Hasta la fecha, los enfoques de edición del genoma CRISPR/Cas9 se han basado en un mecanismo celular llamado homología. reparación dirigida, que se desencadena por roturas de doble cadena en el ADN. Los investigadores suministran a las células una plantilla que contiene la secuencia deseada, hacen una ruptura de doble cadena específica con la enzima Cas9 y luego esperan para ver si la reparación dirigida por homología incorpora la plantilla para volver a conectar las cadenas. Desafortunadamente, este método es ineficiente (la incorporación es rara) y, a menudo, introduce nuevos errores en forma de indeles aleatorios alrededor de la ruptura, lo que lo hace poco práctico para la corrección terapéutica de mutaciones puntuales.
Así que los investigadores de Harvard, dirigidos por químico y biólogo químico David Liu, probó un enfoque diferente. Primero, inactivaron parte de Cas9 para que no pudiera romper la doble hebra. Luego, unieron Cas9 a una enzima llamada citidina desaminasa que cataliza directamente la conversión de C a U (esencialmente un equivalente de timina, T), sin división del ADN. Enviar esta maquinaria a las células crea un par no coincidente en el objetivo, que comprende la U recién introducida y una base de guanina original (G) en la hebra opuesta. Este [desajuste] distorsiona el ADN, explicó Liu. Crea un pequeño bulto divertido que no parece normal.
El bulto alerta a un mecanismo de reparación celular diferente, la reparación de desajustes, que elimina una de las bases no coincidentes y la reemplaza con el complemento de la restante. Sin ninguna información sobre qué base es incorrecta, la reparación de desajustes produce la conversión deseada de G a A aproximadamente el 50 por ciento de las veces; el resto del tiempo vuelve a convertir la U en una C.
Pero la reparación de desajustes incorpora más información cuando está disponible: detecta pequeñas roturas en la columna vertebral del ADN llamadas muescas. Las células han desarrollado una maquinaria de reparación de desajustes para priorizar el ADN viejo sobre el ADN recién sintetizado, dijo Liu. El ADN recién sintetizado tiende a tener algunas muescas. Así que razonamos que podríamos manipular la reparación de desajustes para favorecer la corrección de la hebra de ADN que no queremos, es decir, la hebra que contiene la G.
El equipo volvió a modificar Cas9, esta vez para que creara una muesca en la hebra que contiene G no editada, mientras deja intacta la hebra que contiene U editada. Ahora la célula dice: Ajá, hay una falta de coincidencia aquí, y la base defectuosa debe ser la G, porque debe ser una hebra recién sintetizada porque tiene una muesca, dijo Liu. Preferiblemente corregirá esa G, usando la otra hebra como plantilla.
Usando la técnica en seis loci en células humanas, el equipo informó una tasa de corrección de base objetivo de hasta el 37 por ciento, con solo alrededor de 1 porcentaje de las secuencias que muestran indeles. Por el contrario, una técnica de edición Cas9 normal probada en tres de esos loci mostró menos del uno por ciento de eficiencia y más del cuatro por ciento de formación de indeles. Los investigadores también demostraron el potencial de las técnicas para corregir mutaciones asociadas a la enfermedad convirtiendo una variante de APOE, un gen relacionado con el Alzheimer, en una versión de menor riesgo en células de ratón.
Al diseñar este Cas9, han descubierto una manera realmente agradable de engañar a la célula para que prefiera caminos que normalmente no preferiría, dijo Corn. Sin embargo, debido a que el método actualmente solo puede convertir pares de bases CG a UA (es decir, TA) y, en algunos casos, edita otras bases C en las inmediaciones del objetivo, ciertamente no es una panacea, advirtió. No significa que ahora puedas curar todas las enfermedades genéticas que existen. Pero probablemente habrá bastantes que encajen en esta categoría.
La Universidad de Oxfords Tudor Fulga calificó la técnica como una idea extremadamente ingeniosa para evitar la reparación ineficiente dirigida por homología y para reducir la indelización no deseada. formación. Creo que esto establecerá un cambio de paradigma en el campo, le dijo a The Scientist. Es muy probable que el impacto de la edición de base mediada por Cas9 sea enorme, tanto en términos de respuesta a preguntas básicas de investigación como en aplicaciones terapéuticas basadas en ingeniería genómica.
También aparece en Nature hoy hay dos estudios que abordan una posible alternativa a Cas9: la enzima Cpf1. CRISPR/Cpf1 crea extremos salientes pegajosos en el ADN dividido que dejan bases desapareadas a ambos lados de la ruptura en lugar de los extremos romos creados por la división del ADN de doble cadena de Cas9.
Emmanuelle Charpentier y colegas del Instituto Max Planck de Biología de Infecciones en Alemania han demostrado que, a diferencia de Cas9, Cpf1 procesa el ARN además de escindir el ADN. Mientras tanto, Zhiwei Huang del Instituto de Tecnología de Harbin, China, y sus colegas han descrito la estructura cristalina de CRISPR/Cpf1.
Los extremos pegajosos son más eficientes [que los extremos romos] para la reparación del ADN en las células, dijo Huang. El científico. Creemos que [comprender] la estructura de Cpf1 nos ayudará no solo a conocer el mecanismo de trabajo de Cpf1, sino también a diseñar herramientas de edición del genoma más específicas y eficientes.
D. Dong et al., La estructura cristalina de Cpf1 en complejo con CRISPR RNA, Nature, doi:10.1038/nature17944, 2016.
I. Fonfara et al., La enzima de corte de ADN asociada a CRISPR Cpf1 también procesa el precursor de ARN CRISPR, Nature, doi:10.1038/nature17945, 2016.
AC Komor et al., Edición programable de una base objetivo en ADN genómico sin división de ADN de doble cadena, Nature, doi:10.1038/nature17946, 2016.
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