Próxima generación: seguimiento ultrarrápido de moléculas individuales
FLICKR, MILOSZ1La técnica: La cámara promedio con dispositivo de carga acoplada (CCD) montada en un microscopio fluorescente puede tomar imágenes cada 100 milisegundos ( milisegundo). Pero, ¿y si una proteína fluorescente en estudio se mueve más rápido que eso? Una nueva técnica de manipulación de fase desarrollada por un grupo de ingenieros de la Universidad Rice en Houston, Texas, ahora puede resolver la dinámica de estas proteínas de rápido movimiento sin la necesidad de una cámara costosa y de velocidad de cuadro más rápida. El grupo describió su truco óptico el mes pasado (24 de octubre) en The Journal of Physical Chemistry Letters.
Los investigadores «han desarrollado un nuevo método para extraer la dinámica de una sola molécula que son 20 veces más rápidos que el tiempo impuesto por las velocidades de fotogramas de la cámara [CCD],” Julie Biteen de la Universidad de Michigan, que no participó en la investigación, escribió en un correo electrónico a The Scientist. «Esto es importante porque en mi laboratorio, por ejemplo, consideramos la dinámica de las proteínas dentro de los seres vivos…
El nuevo enfoque es totalmente compatible con todas las metodologías existentes [de microscopía de superresolución] y en particular, todo el equipo existente, por lo que es solo una forma elegante de obtener información más rápida, agregó.
Antecedentes: La microscopía con resolución supertemporal (STReM) funciona mediante la manipulación las propiedades de la luz para obtener información adicional, dijo Christy Landes de la Universidad Rice, quien dirigió el desarrollo de métodos. Con la luz, tienes la intensidad (qué tan fuerte es), el color (esa es la longitud de onda), y luego tienes la dirección de la onda (esa es la información de fase), dijo. La mayoría de las cámaras detectan solo la intensidad y el color para producir imágenes en 2D, explicó Landes, pero si también pueden fabricarse para detectar la dirección de las ondas, entonces esas imágenes en 2D pueden producir más datos.
De hecho, los científicos desarrolló previamente una herramienta, llamada máscara de fase de doble hélice, que interfiere con la luz emitida por una muestra de modo que es posible obtener información sobre la disposición tridimensional de moléculas fluorescentes individuales. Landes y sus colegas ahora han utilizado esa misma máscara de fase de doble hélice para obtener información sobre el tiempo.
Cuando una sola molécula fluorescente se ve a través de una máscara de fase de doble hélice, aparece como un doblete de puntos brillantes, más bien de una. Si la muestra observada es una celda de 3 Da, por ejemplo, la posición de la molécula en el eje z se puede determinar por la orientación del doblete porque, a medida que el punto de enfoque del microscopio se mueve a través de la muestra, el doblete parece girar ( creando una trayectoria helicoidal).
Novedades: Para obtener información temporal en lugar de tridimensional, dijo Landes, deben suceder dos cosas. En primer lugar, el investigador debe observar una rebanada esencialmente bidimensional de la célula tridimensional. Esto se puede lograr iluminando la muestra en un ángulo oblicuo (una técnica llamada fluorescencia de reflexión interna total o TIRF). En segundo lugar, la propia máscara de fase de doble hélice debe girarse a una velocidad correspondiente al tiempo de exposición de la cámara. Mediante este método, la orientación de un doblete en la imagen resultante se relaciona, no con la posición tridimensional de las moléculas, sino con el tiempo dentro de la exposición de 100 ms en el que se capturó.
Tenemos que dar 3-D [información] para obtener la información de tiempo, dijo Landes, pero pueden ocurrir muchas dinámicas en lo que es esencialmente una porción 2-D. Por ejemplo, dijo, en la escala de superresolución, una membrana celular es prácticamente bidimensional.
Como prueba de principio, Landes y sus colegas obtuvieron imágenes de la adhesión y liberación de proteínas marcadas con fluorescencia a un cubreobjetos de vidrio con una resolución de tiempo de aproximadamente 5 ms.
En la imagen fija, en realidad se ven algunas dinámicas temporales que de otro modo no podría captar, dijo Matthew Lew de la Universidad de Washington en St. Louis, quien sí lo hizo. no participar en el proyecto. Es una forma realmente ingeniosa de obtener una alta resolución temporal con la tecnología existente.
El costo: Para hacer girar la máscara de fase de doble hélice, el dispositivo simplemente se fijó a un soporte giratorio en un costo de unos pocos cientos de dólares, dijo Landes.
Es posible comprar cámaras de alta tecnología con velocidades de cuadro más rápidas, dijo Biteen, pero pueden ser prohibitivamente costosas, y no todos los problemas justifican una solución de $100,000. .
W. Wang et al., Microscopía de resolución supertemporal (STReM), Journal of Physical Chemistry Letters, 7:45244529, 2016.
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