El futuro del ARNi en la detección de objetivos de fármacos

Interferencia de ARN WIKIMEDIA, RICHARD ROBINSON

Cuando los investigadores del Laboratorio Cold Spring Harbor se propusieron confirmar las células cancerosas’ dependencia de MELK, un gen que codifica una proteína quinasa que innumerables estudios de ARN de interferencia (ARNi) han demostrado que es esencial, no esperaban nada inusual. Pero luego descubrieron que eliminar MELK con el editor de genes CRISPR-Cas9 no tenía ningún efecto observable en las células cancerosas, lo que revolucionó investigaciones anteriores.

“El estudio fue cuidadosamente hecho, fue meticuloso” Alexey Terskikh, investigador del cáncer del Instituto de Descubrimiento Médico Sanford Burnham Prebys, que no participó en el trabajo, le dijo a The Scientist cuando se publicó el artículo en eLife el mes pasado. Proporciona un ejemplo de “por qué las personas deberían usar CRISPR para una forma más rigurosa de hacer sus preguntas” agregó.

El estudio estuvo lejos de ser el primero en contradecir los hallazgos informados sobre genes esenciales y, por lo tanto, dianas farmacológicas plausibles, a partir de experimentos realizados con…

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Es justo decir que el ARNi ha tenido problemas durante mucho tiempo, dijo Michael Bassik, de la Universidad de Stanford, y agregó que estudios como el artículo eLife sobre MELK socavar la confianza en la tecnología. Tiene que hacerlo, en algún nivel. Ciertamente, si solo lee este documento y se pregunta, ¿debería usar una pantalla RNAi o una pantalla CRISPR? la respuesta sería: usar totalmente una pantalla CRISPR.

Pero, ¿señala el final del camino para el ARNi como identificador de nuevos objetivos farmacológicos? No necesariamente. Tienes que tener mucho cuidado al hacer ese tipo de declaraciones radicales, dijo Bassik. Esta última grieta en la armadura de RNAi no significa que la detección de RNAi vaya a ser inútil para identificar interacciones farmacológicas, agregó.

Mala reputación

RNAi usa RNA pequeñas moléculas de ARN de interferencia (siARN) o ARN de horquilla corta (shARN) para desencadenar la degradación de los ARN mensajeros diana (ARNm) con secuencias complementarias, amortiguando así la expresión de genes específicos en una célula. La técnica se volvió particularmente popular para la identificación de objetivos farmacológicos alrededor de 2007, luego de una pantalla de ARNi de todo el genoma que identificó genes relacionados con una mayor sensibilidad a un medicamento de quimioterapia.

Pero la acción del ARNi es notoriamente imprecisa. A estas alturas, creo que todo el mundo es consciente de los efectos no deseados del ARNi, dijo Ren Bernards, del Instituto del Cáncer de los Países Bajos, que utiliza tanto ARNi como CRISPR en su laboratorio. Es el mayor inconveniente de la tecnología. Las moléculas de ARN introducidas no solo pueden interactuar con secuencias de transcripción fuera del objetivo con una especificidad inquietantemente baja, sino que también interfieren de manera impredecible con la maquinaria celular que regula la expresión génica.

Eso puede tener efectos bastante generalizados, dijo Bassik, y agregó que cuando esos efectos son tóxicos, los investigadores pueden terminar con una noción equivocada del papel de los genes en la célula. Hay muchos ejemplos en los que las compañías farmacéuticas han utilizado los resultados de ARNi para priorizar los objetivos de los medicamentos, solo para descubrir que esos resultados estaban equivocados.

Uno de los ejemplos más infames de un objetivo mal identificado es STK33, un proteína quinasa que los investigadores identificaron en 2009 como esencial para la viabilidad de las células cancerosas humanas que albergan una versión mutante de un oncogén conocido. Los resultados de los estudios originales no se pudieron replicar en otros laboratorios, y más tarde se demostró que STK33 no era esencial en absoluto, aunque no antes de que atrajera una considerable atención de la industria farmacéutica como un posible objetivo farmacológico.

No es de extrañar, luego, que a medida que la edición de genes CRISPR-Cas9 se vuelve cada vez más precisa, ha habido un interés creciente en torno al potencial de las tecnologías para superar al ARNi en la búsqueda de nuevos objetivos farmacológicos. Múltiples laboratorios, incluidos los grupos Bassiks y Bernardss, han llevado a cabo recientemente comparaciones directas de pantallas realizadas con las dos tecnologías.

Los efectos fuera del objetivo son obviamente mucho menos graves cuando tratamos con reactivos CRISPR, dijo Bernards. La [tecnología] es mucho más selectiva. A partir de su comparación de grupos de la reproducibilidad de los métodos, está muy claro que las pantallas CRISPR son menos ruidosas, agregó. Creo que todos los laboratorios han llegado a la misma conclusión.

Como resultado, algunos laboratorios realmente se han alejado de RNAi y han sustituido a CRISPR, dijo Tim Mitchison, de la Escuela de Medicina de Harvard, quien trabajó anteriormente en MELK. Mucha gente piensa que CRISPR es simplemente una mejor manera de hacer las cosas.

No es el final

A pesar de una aparente falta de confianza en las pruebas de ARNi, muchos los investigadores aún no están listos para renunciar a la tecnología para la identificación de objetivos farmacológicos. La eliminación de ARNi y la eliminación de CRISPR funcionan de diferentes maneras: activando la inhibición parcial y total de la expresión génica, respectivamente. Esta distinción se vuelve particularmente relevante cuando se considera el desarrollo de fármacos.

Es muy raro que un fármaco produzca una inhibición del 100 por ciento de un objetivo, señaló Bernards. Podría argumentar que si necesita eliminar por completo toda la proteína para provocar un fenotipo, ¿cuál es la probabilidad de que un fármaco [reproduzca] eso? La respuesta quizás no sea muy probable.

El ARNi puede tener la ventaja en este aspecto por ahora, agregó, aunque CRISPR pronto podría ponerse al día, gracias a la interferencia de CRISPR (CRISPRi), una tecnología que aprovecha la especificidad de CRISPR. para mediar en la inhibición parcial de la transcripción.

Otra razón por la que el ARNi podría sobrevivir a los baches recientes en el camino, argumentan algunos investigadores, es que los errores del pasado se reflejan menos en la tecnología que en la metodología defectuosa que a veces se usa en su aplicación. Idealmente, los resultados de la eliminación del ARNi deberían validarse con lo que los investigadores llaman el estándar de oro, explicó Bernards.

Usted recupera una versión del [gen] que es resistente al ARNi, por ejemplo, con una secuencia de sitio objetivo mutada y ve si eso rescata el fenotipo, dijo, y agregó que este procedimiento falta en muchos estudios de ARNi sobre posibles objetivos farmacológicos. Si no haces eso, te expones a posibles problemas. (MELK recibió el tratamiento de rescate en células de glioblastoma en 2013, aparentemente sin contratiempos).

CRISPR, por supuesto, todavía tiene sus propios problemas. Ralph Garippa, director de RNAi Core en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center en la ciudad de Nueva York, señaló que las mejoras en las bibliotecas de RNA que guían CRISPR a sitios específicos en el genoma lograron menos efectos fuera del objetivo solo recientemente. No cero, sino menos, enfatizó, y agregó que las bibliotecas de ARNi, mientras tanto, se mejoran continuamente. Con cualquier tecnología emergente, hay que luchar contra los matices y las deficiencias, dijo Garippa a The Scientist.

Mientras tanto, una solución obvia al problema de la identificación y validación de objetivos es utilizar tanto CRISPR como RNAi para validar un objetivo antes de pasar a la investigación clínica, en lugar de depender de un solo método. Tenemos reactivos CRISPR y de horquilla corta para cada gen en el genoma humano, dijo Bernards. Entonces, cuando vemos un fenotipo con CRISPR, lo validamos con horquilla corta y viceversa. Creo que sería ideal.

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