Detección rápida y económica del zika
Se ha utilizado una configuración de campo para ensayos LAMP para detectar neumonía en el borrego cimarrón y podría ayudar en la detección del zika. y rentable, según los investigadores que describieron una nueva técnica en Science Translational Medicine hoy (3 de mayo). El ensayo, que se basa en la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), puede distinguir entre las cepas asiáticas y africanas del virus y, en teoría, podría usarse para la detección del virus directamente de los mosquitos en el campo.
“Simplemente puede tomar mosquitos y triturarlos, o tomar muestras de sangre y otros tipos de muestras de humanos infectados y buscar directamente la presencia de Zika” dijo Richard Kuhn de la Universidad de Purdue en Indiana, quien no participó en el trabajo. “No tiene que hacer la purificación [ARN], no tiene que hacer la transcripción inversa, así que…
El enfoque permite realizar pruebas en entornos remotos sin necesidad de equipos caros y sofisticados. , agregó Desiree LaBeaud de la Universidad de Stanford, quien tampoco participó en la investigación. Podría ser útil para la vigilancia de vectores y también para el diagnóstico clínico.
La infección por el virus del Zika generalmente provoca una enfermedad febril de corta duración, o es asintomática. Pero el virus también se ha relacionado con el síndrome de Guillain-Barr y otros problemas neurológicos en adultos, así como con microcefalia fetal y otros problemas congénitos si las mujeres embarazadas están expuestas.
Aunque el Zika se identificó por primera vez en humanos en África en 1952, no fue hasta el reciente brote de una cepa asiática del virus en América del Sur y Central que se determinó el vínculo con la microcefalia. La cepa asiática tiene diferencias de secuencia significativas con la cepa africana, lo que puede haber alterado su virulencia, patología o eficiencia de transmisión. Ahora que la cepa asiática se está extendiendo a lo largo y ancho, y posiblemente extendiéndose al territorio de las cepas africanas, distinguir las dos puede volverse aún más importante.
El virus Zika en mosquitos o humanos generalmente se detecta en un laboratorio usando un reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). Sin embargo, a medida que surgen infecciones en nuevas ubicaciones, las tareas de vigilancia de mosquitos, diagnósticos e identificación de cepas se simplificarán con un ensayo de campo fácil y económico, dijo Joel Rovnak, de la Universidad Estatal de Colorado, quien dirigió el nuevo estudio. Y tuvo una brillante idea de cómo hacer uno. Ya habíamos estado desarrollando un ensayo LAMP [basado en el campo]. . . para detectar organismos de la neumonía en el borrego cimarrón, dijo. Así que sugerí que lo aplicáramos al Zika.
Al igual que la PCR, LAMP amplifica las secuencias de ADN diana utilizando cebadores de secuencia coincidente. Pero a diferencia de la PCR, que requiere ciclos continuos de la mezcla de reactivos a diferentes temperaturas, LAMP procede a una temperatura constante de 63 C. Esto significa que en lugar de comprar una máquina termocicladora de PCR, que oscila entre $15 000 y $20 000, dijo Rovnak, pagamos $250 por un bloque de calor.
El Zika es un virus de ARN, y su amplificación requiere que se convierta en ADN. Una enzima transcriptasa inversa realiza esta función y se ha utilizado tanto para PCR (RT-PCR) como para LAMP (RT-LAMP). Pero hubo alguna evidencia de que la ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus utilizada para los ensayos LAMP también funciona como una transcriptasa inversa. De hecho, Rovnak descubrió que la actividad de la transcriptasa inversa de las enzimas es bastante profunda, lo que significa que podría realizar tanto la conversión del ADN como los pasos de amplificación.
Al eliminar el paso de la transcripción inversa y usar un bloque de calor simple, al que conectamos una batería de camión, dijo Rovnak, sin duda haría que el ensayo fuera más barato y más móvil que la RT-PCR. Pero, ¿qué pasa con el aislamiento del ARN en primer lugar? Rovnak también tenía una solución simple y fácil de usar para eso.
Hace veinte años, comencé a hacer RT-PCR en lisados celulares simples, dijo Rovnak, así que sabía que esencialmente no tiene que aislar ARN de las muestras para proceder a la amplificación. Efectivamente, simplemente aplastando mosquitos infestados de Zika, añadiéndolos a tubos que contenían reactivos LAMP e incubando la suspensión a 63 C, el equipo pudo amplificar el virus de manera sólida (identificando correctamente 15 de 15 insectos infectados y 3 de 3 controles negativos ).
Aunque el equipo aún no ha realizado el ensayo en mosquitos en el campo, todos los componentes están listos para hacerlo, dijo Rovnak. Los investigadores también demostraron que podían distinguir las cepas de Zika africanas y asiáticas directamente de las células infectadas.
Con el fin de utilizar el ensayo para el diagnóstico de pacientes, el equipo amplificó la cepa asiática directamente del plasma, suero , y muestras de semen de individuos infectados, aunque esto produjo algunos falsos positivos y negativos que, según Rovnak, se debieron a sustancias inhibidoras mal definidas.
El enfoque LAMP necesitaría un desarrollo considerablemente mayor antes de que pudiera convertirse en una herramienta de diagnóstico, dijo Rovnak, pero alentadoramente es tan robusto, preciso y sensible como RT-PCR, pero los reactivos cuestan aproximadamente la mitad.
N. Chotiwan et al., Detección rápida y específica de virus Zika de linaje asiático y africano, Science Translational Medicine, 9:eaag0538, 2017.
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