Cuantificación de glicanos para el descubrimiento de biomarcadores
RICHARD CUMMINGSLos glicanos son parte de un elaborado sistema de comunicación vital para el reconocimiento celular, las interacciones entre células, el transporte de proteínas, la defensa inmunitaria y más. Estas estructuras tridimensionales de azúcar adheridas a la mayoría de las proteínas codifican una gran cantidad de información que los investigadores apenas están comenzando a aprovechar (consulte «Obtenga su dosis de azúcar», The Scientist, abril de 2015). “Con los glicanos, hay varios niveles de información” dice Carlito Lebrilla, químico de la Universidad de California, Davis: el número de posiciones que llevan un glucano, la ubicación de cada uno de esos glucositos y la composición química y la estructura de ramificación de cada glucano. A pesar de ser la modificación postraduccional más común, la complejidad de la glicosilación ha dejado a la glicobiología rezagada con respecto a otros campos, como el análisis de secuencias de proteínas y la genómica. Pero eso está cambiando, ya que los investigadores identifican la glicosilación como un actor importante en muchas enfermedades, incluido el cáncer. Un puñado de glicoproteínas aberrantes ya se utilizan como…
Mejora del etiquetado
Investigador: David Muddiman, Profesor, Departamento de Química, Universidad Estatal de Carolina del Norte
Proyecto: Para investigar los cambios en las firmas de glicanos séricos en diferentes etapas del cáncer de ovario.
Problema: Una forma fácil y ampliamente utilizada de comparar la regulación de glicanos en estados saludables y enfermos es liberar enzimáticamente todos los glicanos en una muestra determinada de sus proteínas y analizarlos al por mayor. Los investigadores utilizan la espectrometría de masas de marcado de isótopos estables para identificar la regulación al alza o a la baja de ciertos glicanos entre las muestras. Los glicanos de una muestra reciben una etiqueta de isótopo ligero, como C12, mientras que en la otra muestra se adjunta un isótopo de carbono más pesado, como C13, y la abundancia relativa de cada ion revela la abundancia relativa de los glicanos marcados. Una forma común de unir estos isótopos a los glicanos libres es agregar grupos metilo marcados con isótopos estables mediante un método llamado permetilación. Los datos generados a través de esta técnica son muy variables, sin embargo, porque metila un número variable de grupos hidroxilo de un glicano dado. No se necesita mucho para que la permetilación sea difícil de cuantificar, dice Muddiman. Cuanta más variabilidad analítica tenga, menos capacidad tendrá para extraer una firma biológica sutil.
Solución: En 2013, Muddiman y sus colegas desarrollaron un flujo de trabajo para mejorar la reproducibilidad y la sensibilidad de la cuantificación de glicanos mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (J Am Soc Mass Spectrom, 24:1376-84, 2013). Su técnica, denominada normalización de la individualidad al etiquetar con etiquetas isotópicas de hidrazida de glucano (INLIGHT), etiqueta los glucanos con una estequiometría uno a uno, lo que reduce la variabilidad y mejora la sensibilidad del análisis cuantitativo. La etiqueta hidrofóbica también hace que los glicanos sean más fáciles de ionizar, mejorando la detección por espectrometría de masas. En su estudio, el equipo publicó un código que utiliza modelos multivariados para identificar glicanos individuales con abundancias significativamente diferentes entre muestras. Cualquiera puede simplemente tomar ese código y modificarlo para su estudio, dice Muddiman.
Más tarde, su grupo usó INLIGHT para identificar once glucanos plasmáticos que estaban alterados en 82 mujeres con cáncer de ovario en comparación con los controles de casos (J Proteoma Res, 14:4394-401, 2015). El método INLIGHT les permitió detectar cambios en la abundancia de glicanos tan bajos como el 17 por ciento. Ahora están usando la estrategia para analizar muestras de gallinas que desarrollan espontáneamente cáncer de ovario en busca de glucanos cuya abundancia cambia a lo largo del curso de la enfermedad.
Los reactivos INLIGHT están disponibles comercialmente en Cambridge Isotope Laboratories ( $950 por kit, alrededor de 25 experimentos). El equipo de Muddiman ahora está ajustando la polaridad de los reactivos para aumentar su señal de espectrometría de masas. Esta etiqueta ha sido tremenda para nosotros, pero éramos científicos, por lo que siempre queremos mejorar las cosas, dice.
Glicanos en sus hábitats naturales
MAPEO: uso de masa de imágenes de desorción/ionización láser asistida por matriz espectrometría (MALDI IMS), Anand Mehta y sus colegas visualizaron dos glicanos que se sabe que están presentes en los riñones de los ratones (que se muestran en el gráfico espectral anterior). Los investigadores liberaron los glucanos al exponer los riñones a una versión recombinante de la enzima PNGaseF (CE). Un control negativo (F) mostró que los glucanos no eran detectables a menos que se expusieran a la enzima. Los mapas de calor (C y D) mostraban la abundancia de cada glicano y una superposición de color (E) en la que un glicano es verde y el otro es púrpura demostraba sus distribuciones en el borde exterior o centro de la sección de tejido.PLOS ONE, doi:10.1371/journal.pone.0106255, 2014
Investigador: Anand Mehta, Profesor, Departamento de Farmacología Celular y Molecular; Richard Drake, Profesor, Departamento de Farmacología Celular y Molecular y Director, Centro de Proteómica, Universidad Médica de Carolina del Sur
Proyecto: Identificar cambios en la glicosilación de proteínas que puedan servir como biomarcadores tempranos de cáncer de hígado.
Problema: El análisis a granel de glucanos del suero o tejido homogeneizado no diferencia el tejido enfermo del tejido sano cercano. Cuando Mehta y sus colegas analizaron los perfiles de glicanos de tejido tumoral hepatocelular homogeneizado y tejido sano adyacente, no vieron ninguna diferencia detectable. Así que él y Drake se dispusieron a mapear los glicanos dentro de muestras de tejido intactas fijadas con formalina o congeladas utilizando espectrometría de masas de imágenes de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI IMS). El problema, dice, fue la liberación enzimática de glicanos sin destruir el tejido o arruinar el banco. Los glucanos generalmente se liberan del tejido mediante la aplicación de una enzima llamada péptido N-glucosidasa F (PNGasa F), pero rociar el tejido con la cantidad requerida era demasiado costoso. La falta de una enzima [asequible] fue una de las razones por las que nadie lo había hecho, dice Mehta.
Solución: Mehta y Drake diseñaron una versión recombinante de menor costo de PNGase F, que ahora está disponible comercialmente en Bulldog Bio ($ 250 por 100 microlitros), lo que reduce el costo del proceso tres veces a $ 1 por sección de tejido. (Anal Chem, 85:9799-806, 2013; PLOS ONE, doi:10.1371/journal.pone.0106255, 2014). El proceso MALDI IMS en sí mismo es similar al análisis proteómico, dice Mehta. Los investigadores identificaron los glicanos por masa o por disociación inducida por colisión en el tejido y crearon mapas de calor que revelaron la abundancia relativa de glicanos en el cerebro del ratón y el tejido renal humano. Cuando aplicaron el método a muestras de carcinoma hepatocelular, las diferencias entre los tumores y el tejido adyacente fueron sorprendentes, dice Mehta (Biomolecules, 5:2554-72, 2015).
VER PARA CREER: Después de liberar glicanos con un nueva enzima recombinante, Anand Mehta y sus colegas usaron MALDIIMS para visualizar los glucanos en muestras de tejido normal y con cáncer de hígado. Los glicanos se identificaron por sus proporciones de masa a carga (m/z) y los mapas de calor representaron las abundancias relativas de cada uno (A y B). También se compararon los niveles de dos glicanos asignando colores a los glicanos individuales (rojo para el glicano en A y verde para el glicano en B) y superponiendo sus señales (C).BIOMOLECULES, 5:2554-72 , 2015
Dado que la técnica se basa en la masa, explica Mehta, no puede distinguir diferentes isómeros del mismo glicano. Sin embargo, él y sus colegas están desarrollando enzimas recombinantes con especificidad isomérica. Podemos usar esas enzimas para aclarar qué azúcares hay realmente allí, dice. También han adaptado la técnica para detectar un glicano llamado ácido siálico, que a menudo se destruye durante el análisis (Anal Chem, 88:5904-13, 2016), y un método para emparejar los glicanos liberados con sus glicopéptidos (Anal Chem, 88: 7745-53, 2016).
Obteniendo detalles
EN PUNTO: El equipo de Carlito Lebrillas usó el monitoreo de múltiples reacciones para cuantificar los glucanos específicos que todavía están unidos a los fragmentos peptídicos de las proteínas de inmunoglobulina sérica. La técnica les permitió concentrarse en fragmentos específicos (representados por picos de colores) que contienen glucanos conocidos y comparar la abundancia de cada glucopéptido entre dos muestras.J. PROTEOME RES, 14:5179-92, 2015
Investigador: Carlito Lebrilla, Profesor, Departamento de Química, Universidad de California, Davis
Proyecto: Caracterizar la glicosilación de proteínas séricas y de leche materna de individuos sanos y enfermos.
Problema: La cuantificación de glicanos libres por definición omite información sobre los niveles de proteínas anteriormente unidas a esos glicanos. Por lo general, dice Lebrilla, se sacrifica una forma de información por otra. Por ejemplo, puede determinar estructuras de ramificación detalladas de glicanos libres individuales o cuántos sitios de unión de glicanos en una proteína están ocupados, pero generalmente no ambos.
Solución: Lebrilla se propuso idear una forma de cuantificar los glucanos en sitios específicos de las glicoproteínas y distinguir los cambios en los niveles de glucanos de los cambios en los niveles de proteínas. Los miembros del laboratorio de Lebrillas dedican gran parte de su tiempo a mapear sistemáticamente los sitios de glicosilación en las proteínas comunes del suero y la leche materna. Tener tales mapas hizo posible usar un tipo de espectrometría de masas llamada monitoreo de reacción múltiple (MRM) para comparar la abundancia de glicanos específicos del sitio entre muestras. MRM utiliza un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo, lo que permitió al equipo de Lebrillas localizar una especie de iones de interés y establecer los parámetros para optimizar la detección de esa especie. Además, utilizaron la ionización por electropulverización para aumentar la carga de los péptidos digeridos con tripsina, lo que los hace encajar dentro del estrecho rango de detección de masas del instrumento de triple cuadrupolo. Debido a que MRM les permitió seleccionar qué iones medir, pudieron cuantificar muestras directamente del suero, lo que les permitió omitir el paso de enriquecimiento de proteínas que normalmente se requiere. Mientras su sensibilidad sea lo suficientemente buena, no importa qué más haya, dice Lebrilla.
El equipo de Lebrilla usó MRM para cuantificar glicoformas específicas unidas a inmunoglobulinas (Anal Chem, 85:8585-93, 2013; J Proteome Res, 14:5179-92, 2015). Luego usaron la información para comparar la abundancia de péptidos glicosilados del suero donado por pacientes con cáncer de ovario con los de controles sanos (J Proteome Res, 15: 1002-10, 2016) y probaron la utilidad de los perfiles de glicopéptidos como un panel de biomarcadores potenciales. El grupo Lebrillas también está utilizando MRM para identificar biomarcadores de glicoproteínas específicos de sitio en autoinmunidad y enfermedades metabólicas.
Poniendo todo junto
SEPARACIÓN BASADA EN PERLAS: Hui Zhang y sus colegas desarrollaron extracción en fase sólida de glicanos ligados a asparagina y péptidos que contienen glucositos (NGAG) para cuantificar glucanos y glicoproteínas de muestras complejas simultáneamente. Unieron glicopéptidos digeridos a perlas de hidrazida (2) y usaron grupos de anilina para proteger los glicanos y los extremos carboxilo expuestos de las proteínas (3). La anilina también bloquea los grupos carboxilo en el ácido aspártico y el ácido glutámico (no se muestra). Los péptidos permanecen adheridos a las perlas después de que se liberan los glucanos (4), lo que permite separarlos mediante centrifugación.
Investigador: Hui Zhang, Profesor, Departamento de Patología y Director, Instalación Central de Espectrometría de Masas, Centro para el Descubrimiento y Traducción de Biomarcadores, Universidad Johns Hopkins
Proyecto: Zhang desarrolla métodos de alto rendimiento para analizar cambios en glicoproteínas séricas y tisulares asociadas con diferentes tipos de cáncer.
Problema: Hace quince años , Zhang desarrolló una técnica llamada extracción en fase sólida para cuantificar glicoproteínas e identificar sus sitios de unión a glucanos, pero solo después de que se hubieran eliminado todos los glucanos. Esta limitación aún se aplica a la mayor parte del campo: un laboratorio como Lebrillas puede estudiar glicopéptidos intactos después de que se hayan mapeado los glucositos, pero en su mayor parte, los laboratorios se enfocan en glucanos liberados o glucositos vacíos en proteínas. Tratamos de integrar todas estas cosas en una sola tubería, dice ella.
Solución: Zhang y sus colegas reelaboraron el método de extracción en fase sólida para que pudieran recopilar información sobre glucanos, glicoproteínas y glucositos, todo a la vez. (Nat Biotechnol, 34:84-88, 2016). El método, al que denominan extracción en fase sólida de glicanos ligados a N y péptidos que contienen glicositos (NGAG), comienza con la unión de los glucopéptidos digeridos a perlas de hidrazida y la estabilización de los péptidos y los glicanos unidos cubriendo cada grupo carboxilo y cada glicano con un compuesto químico llamado anilina. Debido a que los péptidos están adheridos a las perlas, los glucanos se pueden escindir y separar fácilmente mediante centrifugación en placas de 96 pocillos. La eliminación del glicano revela un ácido aspártico donde se unió el glicano, y dado que todos los demás ácidos aspárticos están ocultos por grupos de anilina, es fácil identificar dónde se unieron las cadenas de glicano/oligosacáridos. A continuación, los péptidos se liberan de las perlas mediante una enzima que corta específicamente el ácido aspártico expuesto.
Después de la separación, los glicanos liberados y los péptidos identificados con glicositos se analizan mediante espectrometría de masas en tándem. El equipo de Zhang usó este método para construir una base de datos con todas las posibles combinaciones de glucano-glucopéptido en una muestra de una línea celular de cáncer de ovario. También desarrollaron un programa llamado GPQuest, disponible en el sitio web de Zhang, biomarkercenter.org, que relaciona los glicanos identificados con sus sitios de unión a proteínas.
El equipo de Zhang ahora usa NGAG para realizar glicoproteómica en suero e identificar biomarcadores para Cancer de prostata. También tiene la intención de simplificar el método en un kit listo para usar.
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