Construyendo una mejor trampa óptica

Cortesía de Matthew J. Lang

Poco después de la invención del láser, el físico Arthur Ashkin de Bell Labs comenzó a explorar el rango de los nuevos dispositivos. ¿Podría la fuerza de la luz en el haz mover un objeto, tanto como un dedo empuja una pelota, se preguntó? Si lo hicieran, confirmaría una vieja teoría que lo había intrigado desde sus días universitarios durante la Segunda Guerra Mundial.1 «Se sabía que un láser podía empujar [una partícula], la pregunta era, ¿podría observarlo?» Ashkin recuerda. Pero también descubrió algo más: "Descubrí cuando hice eso, que había fuerzas que atraían las partículas hacia las regiones de alta intensidad del haz".

Así nació el concepto de «atrapamiento óptico», o "pinzas ópticas" – sistemas de láseres y ópticas que pueden mantener estables objetos de escala micrométrica contra el movimiento browniano. Los experimentos realizados con tales sistemas ganarían el Nobel para varios físicos…

FÍSICA 301: CÓMO FUNCIONA

La captura óptica es solo una de una clase de técnicas llamadas «manipuladores de campo externo, » que usan diferentes fuerzas de campo para controlar las biomoléculas.3 A veces esa fuerza es ligera y a veces es un campo magnético, pero al menos en una ocasión memorable, fue la gravedad. El investigador del Instituto Médico Howard Hughes Carlos Bustamante de la Universidad de California, Berkeley, quien en 1992 usó «pinzas magnéticas» para realizar la primera manipulación directa de una sola molécula cuando midió la elasticidad del ADN,4 recuerda ese experimento de 1991: «Nuestro instrumento era el planeta Tierra», dice, haciendo un remate de un experimento ahora clásico en el que su equipo adjuntó moléculas de ADN a un portaobjetos de vidrio en un extremo y a perlas microscópicas en el otro. «A medida que colocamos más y más cuentas en el extremo del ADN, se hundieron más en el agua y extendieron el ADN, por lo que la primera medición de extensión de fuerza de la elasticidad de una sola molécula se realizó mediante la fuerza gravitacional».</p

Las pinzas ópticas hacen un uso similar de las propiedades de la luz. El físico del siglo XIX James Clerk Maxwell, famoso por las «ecuaciones de Maxwell», predijo hace más de un siglo que una fuerza muy pequeña, llamada «presión de radiación», debería estar asociada con la interacción de la luz con un material. Algunos investigadores exploraron la presión de la radiación a principios del siglo XX, pero no fue hasta la llegada de los láseres en la década de 1960 que existieron fuentes de luz que podían enfocarse lo suficientemente fuerte como para manipular un objeto muy pequeño.

«Puedes generar fuerzas significativas en una perla de poliestireno con una bombilla de 60 vatios», observa Mark Williams, profesor asistente de física en la Universidad Northeastern en Boston. «Es porque esa fuerza se ejerce sobre un objeto del tamaño de una micra que en realidad hace algo perceptible».

En otras palabras, las trampas ópticas deben lidiar con fuerzas en competencia. El atrapamiento es causado por la curvatura de la luz cuando se refracta; el cambio resultante en el impulso de los fotones provoca la atracción de la perla hacia el centro del punto láser. Si la luz se refleja en la superficie, también hay un cambio en el impulso en otras direcciones, lo que hace que la perla sea impulsada fuera de la trampa.

UNA CUESTIÓN DE PRÁCTICA

Lo que realmente hace que las pinzas ópticas funcionen como una práctica herramienta de laboratorio es la capacidad de medir con precisión la posición mientras se ejerce una fuerza. Si realmente puede medir la presión de radiación, entonces puede controlar con precisión la fuerza para manipular la materia, exactamente como si estuviera trabajando con una herramienta mecánica, como unas pinzas de metal. «La localización y la manipulación son la parte crucial», dice Ashkin.

DOS LECTURAS SON MEJORES QUE UNO:

Diseño óptico del instrumento combinado de captura óptica y fluorescencia de una sola molécula de Steven Block, que muestra las vías de luz para el mercurio- transiluminación de arco (verde claro), láser de captura (rojo oscuro), láser de detección de posición (naranja), láseres de excitación de fluorescencia (azul oscuro, verde) y emisión de fluorescencia (rojo). Los fotodetectores incluyen un QPD, una cámara analógica de velocidad de video, una cámara EMCCD digital y un SAPD. Los obturadores electrónicos proporcionan un control automático del haz de captura (S1), el haz de excitación de fluorescencia (S2), la iluminación de campo brillante (S3) y la luz que ingresa al EMCCD/SAPD (S4). Múltiples filtros ópticos aíslan la emisión del láser de diodo (F1) y bloquean las longitudes de onda del láser de trampa, detección y excitación antes de la detección de fluorescencia (F2-F5). Los espejos Flipper alternan entre la cámara de velocidad de video y el subsistema SMF (FM1) y eligen el detector SMF deseado (cámara EMCCD o SAPD) (FM2). (De M. Lang et al., Nature Methods, 1:1339, 2004.)

2004 Nature Publishing Group

Fundamentalmente, un experimento con pinzas ópticas consiste en unir una biomolécula a una perla atrapada y tirar de ella. Entonces es posible preguntarse, ¿cuánta fuerza debo ejercer para disociar un complejo o desnaturalizar un ácido nucleico? La distancia que se mueve la cuenta es directamente proporcional a la fuerza aplicada y se denomina «rigidez de trampa». Es una manifestación de alta tecnología de la Ley de Hooke, F = -kx, donde F es la fuerza, k es la rigidez de la trampa y x es el desplazamiento.

«Una trampa es un resorte tridimensional hecho de luz», explica Block. «Si el resorte está calibrado para cualquier fuerza que le apliques, puedes usarlo como una herramienta de medición. Al medir los movimientos de la perla con una precisión sorprendente, estamos infiriendo los movimientos de la molécula adherida a la perla». /p>

Por supuesto, eso es simplemente una simplificación. «La óptica de rayos funciona bien, siempre que la perla sea más grande que la longitud de onda de la luz», dice Williams. «Con perlas del orden de la longitud de onda de la luz, debe pensar en la fuerza de gradiente debido a un campo eléctrico en un dieléctrico, lo que lleva a cálculos más complicados».

No existe tal cosa como un Configuración de pinzas ópticas «genéricas», porque los líderes en el campo están refinando continuamente el método. Hay, por ejemplo, configuraciones de uno, dos y múltiples haces, cuyas diferentes geometrías producen diferentes fuerzas en las perlas atrapadas.56 Con haces dobles, por ejemplo, puede trabajar más lejos de la lente, y así trabajar más profundo en solución.

Aunque las pinzas magnéticas y ópticas tienen ventajas y desventajas únicas, la manera general de distinguirlas, según Bustamante, es mediante qué técnica funciona mejor con qué nivel de fuerza. Las pinzas magnéticas funcionan mejor con fuerzas muy bajas, por debajo de un piconewton (pN). Las pinzas ópticas son mejores con fuerzas entre 1 y 100 pN. La microscopía de fuerza atómica también se usa en experimentos de una sola molécula; es mejor para fuerzas entre 100 pN y 1 nanonewton.

Mara Prentiss de la Universidad de Harvard dice que su laboratorio se concentra más en pinzas magnéticas, que facilitan mucho la replicación de experimentos. «La mayoría de las pinzas ópticas solo atrapan una partícula a la vez», escribe por correo electrónico. «David Grier de la [Universidad de Nueva York] ha fabricado pinzas que atrapan unas cuantas, y también hemos atrapado varias, pero es difícil hacer cien o mil y tener una profundidad de trampa razonable».

NO INTENTE ESTO EN CASA

Algunas empresas, como Cell Robotics de Albuquerque, N.Mex., y PALM Microlaser Technologies de Bernried, Alemania, ofrecen sistemas de pinzas ópticas preconstruidas. Pero, la mayoría de los laboratorios de investigación organizan los suyos propios. Se puede crear un sistema de captura láser de nivel de enseñanza de un solo haz por unos pocos miles de dólares. «Es solo un objetivo de microscopio y una lente», dice Williams sobre el sistema de $ 4,000 que creó a partir de partes ópticas y un diodo láser monomodo. «No quieres un ocular si estás trabajando con láseres», agrega.

Este sistema puede atrapar bacterias y levaduras, incluso moléculas individuales. Pero si espera sorprenderlos en la Sociedad Biofísica, necesitará una combinación completamente personalizada de óptica, etapas piezoeléctricas y láseres controlados por computadora, que juntos cuestan seis cifras, y más que probable tiempo como posdoctorado con Block o Bustamante. . Jeff Gelles, profesor de la Universidad de Brandeis y colaborador de Block’s, dice que envía a sus alumnos al laboratorio de Block en Stanford para realizar experimentos que requieren mediciones calibradas con mucha precisión.

En el laboratorio, el equivalente a desmontar un Lexus por piezas, algunos los laboratorios construyen sus sistemas destruyendo y modificando microscopios ópticos de alta gama. Otros simplemente construyen sus propios sistemas desde cero. Matthew Lang, profesor asistente de ingeniería biológica en el Instituto Tecnológico de Massachusetts, sugiere que una de las ventajas de comenzar con un microscopio estándar es que resulta familiar para los colaboradores externos y, por lo tanto, puede facilitar las operaciones básicas como cargar muestras.

STRETCH ¿GENES?

Este instrumento de pinzas ópticas de doble haz se utiliza para estirar el ADN. Los objetivos del microscopio enfocan dos rayos láser en el mismo lugar, atrapando una esfera de poliestireno. Para estirar el ADN, se sujeta por succión otra esfera de poliestireno en el extremo de una micropipeta de vidrio. A medida que la molécula de ADN se estira al mover la micropipeta, ejerce una fuerza sobre la esfera atrapada, lo que hace que se mueva ligeramente. La distancia que recorre es proporcional a la fuerza ejercida por el estiramiento. La fuerza medida resultante revela información sobre la elasticidad, la estabilidad y la interacción de la molécula con el entorno.

Cortesía de Mark C. Williams

Los instrumentos de investigación tienen subsistemas completos dedicados a la detección de posición (detección de desplazamiento). Y no es imposible tener un instrumento con cinco o incluso más fuentes de luz, según Block. «Uno para realizar la captura, otro para la detección de posición, otro para la excitación de fluorescencia y tal vez otro para otro color de excitación de fluorescencia, además de una lámpara de arco de mercurio para proporcionar iluminación».

El desafío para El experimento de resolución de un solo angstrom de Block fue una estabilidad extrema para el instrumento. «Si su sistema se desvía, termina midiendo su sistema, pero no el objeto de interés», dice Block. «Se mide que algo se mueve, pero no la enzima… El verdadero punto clave es que se necesita un sistema que sea ultraestable, sin deriva».

Él explica el desafío de la física básica: «Si Si propagas un rayo láser a través del aire, el rayo láser parpadeará un poco. Se moverá hacia arriba y hacia abajo en cantidades muy, muy pequeñas, y lo hace por la misma razón por la que parpadea una estrella: porque hay fluctuaciones de densidad en el aire. y las fluctuaciones de densidad dan lugar a cambios en el índice de refracción, y estos actúan un poco como una lente para desviar el haz de luz». Normalmente, en microscopía de luz, las fluctuaciones de densidad son demasiado pequeñas para ser un problema, pero ese no es el caso en el nivel de angstrom. Block dice que su laboratorio «ha ido al extremo en los últimos años para construir un sistema que no esté sujeto a la deriva».

Una solución aparentemente obvia, poner todos los instrumentos en el vacío, crea su propio desafíos complicados y engorrosos, dice Block, por lo que su equipo hizo lo siguiente mejor: usaron helio, que tiene un índice de refracción mucho más cercano al del vacío que el del aire, por lo que pequeños cambios en la presión no desviarían la luz.

«Usando luz dispersa, podemos medir el centro de una de las perlas a un tamaño mucho más pequeño que el límite de resolución del microscopio óptico, ya sea mediante interferometría o detección de plano focal posterior», dice Block.

Tom Perkins, miembro asociado de JILA, un instituto de investigación con sede en Boulder, Colorado, administrado conjuntamente por el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología y la Universidad de Colorado, adoptó un enfoque diferente para lograr una resolución de un solo angstrom.7 A diferencia del de Block sistema, que se desacoplaba de la superficie del cubreobjetos para Para reducir el ruido inherente, Perkins usó un segundo láser para medir el ruido de la superficie y luego lo sustrajo en tiempo real. «Si puede configurar un ensayo en el que pueda recoger todo de la superficie, entonces la técnica de Steve es una muy buena opción», dice Perkins, «pero para los ensayos que están inherentemente acoplados a la superficie, la nuestra funcionaría mejor».

FLUORESCENCIA Y EL FUTURO

Aunque gran parte de la bioquímica de una sola molécula se ha logrado con trampas ópticas, existen otras formas de abordar estos problemas. Uno involucra el monitoreo preciso de sondas fluorescentes, por ejemplo, en la superficie de un motor molecular.

Algunos investigadores ahora están construyendo sistemas compuestos que combinan tales mediciones con atrapamiento óptico. Toshio Yanagida de Japón realizó un trabajo pionero en 1998, utilizando un pedestal microfabricado para separar las trampas ópticas de la ubicación de la fluorescencia para evitar el fotoblanqueo. Más recientemente, Block y Lang, su antiguo postdoctorado, demostraron que es posible combinar captura y fluorescencia en el mismo lugar y en la misma molécula.8

Al comentar sobre varias técnicas de manipulación de moléculas individuales, a partir de trampas ópticas desde pinzas magnéticas hasta microscopía de fuerza atómica, Julio Fernández de la Universidad de Columbia, dice: «La instrumentación tiene un largo camino por recorrer, pero al final de ese camino, va a revolucionar nuestra comprensión de las proteínas. Va a cambiar la forma en que los libros están escritos».

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