El ensayo para la anemia de células falciformes se reutiliza para diagnosticar el COVID-19
ARRIBA: Detección de SARS-CoV-2DR basada en Feluda. DEBOJYOTI CHAKRABORTYS LAB, CSIR-IGIB
En 1965, el famoso cineasta indio Satyajit Ray creó un amado detective ficticio llamado Feluda. En una serie de cuentos, el astuto gumshoe rastrea a un vándalo que intenta destruir los templos antiguos de la India, desmantela un negocio de medicamentos falsificados en Katmandú y limpia los relojes de los contrabandistas de Bombay. Inspirados por las grandes habilidades analíticas del detective, los investigadores del Instituto de Genómica y Biología Integrativa del Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR), con sede en Delhi, han dado a su nuevo diagnóstico basado en CRISPR para COVID-19 el apodo cariñoso de Feluda ( abreviatura de FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay). TataMD Check, el nombre comercial de la prueba impulsada por Feluda, se lanzó el 9 de noviembre en India.
La prueba utiliza el sistema CRISPR-Cas para sondear secuencias genéticas específicas del virus SARS-CoV-2 en muestras de hisopos nasales o saliva aplicada a una tira de papel. Al igual que el Feluda ficticio, es rápido, preciso y funciona en todo tipo de entornos de campo, según una preimpresión publicada en medRxiv en septiembre. Las agencias reguladoras de la India realizaron una evaluación independiente del ensayo en muestras de pacientes y encontraron que Feluda es muy precisa para detectar infecciones por COVID-19.
La combinación de precisión, velocidad y asequibilidad en esta tecnología es notable. , dice Prashant Yadav, experto en la cadena de suministro de atención médica y miembro principal del Centro para el Desarrollo Global en Washington, DC, un grupo de expertos respaldado en gran medida por Bill & Fundación Melinda Gates.
El Contralor General de Drogas de India aprobó Feluda para uso comercial el 19 de septiembre, y en un aviso del 22 de octubre, el Consejo Indio de Investigación Médica aprobó su uso en laboratorios públicos y privados. La prueba cuesta alrededor de 500 rupias ($6,75 USD) para hacer y procesar en el laboratorio para una muestra de paciente y da resultados en una hora.
Una vez que se valida a gran escala y se resuelven los problemas de fabricación comercial, puede convertirse en el pilar de las pruebas de COVID-19, no solo en la India sino en muchos otros países del mundo que buscan una prueba rápida, asequible y precisa, dice Yadav, que no está involucrado en el proyecto.
El primer caso informado de COVID-19 en India fue el 30 de enero y la primera muerte el 12 de marzo. Al comienzo de la pandemia, las pruebas se limitaron a unos pocos laboratorios financiados con fondos públicos en India. Más tarde, se extendió a laboratorios privados. Aún así, la capacidad es limitada. En la actualidad, India realiza pruebas solo a alrededor del 0,1 % de su población de 1400 millones cada día, lo que hace que el país se clasifique entre los más bajos del mundo en términos per cápita.
EE. UU. tiene casi la misma cantidad de pruebas por día 1,2 millones, en comparación con los 1,5 millones de la India, pero una población que es más pequeña por un factor de cuatro, explica Gautam Menon, profesor de física y biología en la Universidad de Ashoka y en el Instituto de Ciencias Matemáticas de la India que no participó en la investigación. Pienso que deberíamos evaluar alrededor del 0,5 por ciento de nuestra población todos los días, como ideal, pero estamos haciendo más pruebas que nunca, dice.
A principios de este año, un equipo de investigadores de Pune La empresa de biotecnología MyLab Discovery Solutions desarrolló un kit de prueba PathoDetect para COVID-19 que arroja resultados en 2,5 horas con una precisión del 100 %. Fue la primera prueba de PCR en tiempo real para el nuevo coronavirus fabricada en India que se aprobó en el país. Cuesta alrededor de $16. Para PathoDetect, un factor limitante significativo es el costo de la máquina de PCR en tiempo real, que puede rondar los $26,000 USD.
Feluda, sin embargo, usa una tira de papel para revelar los resultados, similar a la lectura de una prueba de embarazo Cualquiera que pueda ejecutar una máquina de PCR normal y seguir un protocolo de pipeteo simple puede hacer esto, dice el codirector científico Debojyoti Chakraborty. Feluda se puede realizar en cualquier laboratorio de diagnóstico o centro de atención médica que tenga una máquina de PCR simple y sus equipos y reactivos son menos costosos que los de PathoDetect.
El ensayo se ha probado en más de 2000 muestras. Detectó a quienes tenían SARS-CoV-2, una medida de sensibilidad, el 96 % de las veces, y descartó a quienes no tenían el virus, una medida de su especificidad, el 98 % de las veces.
De la anemia de células falciformes al COVID-19
Feluda surgió de la casualidad, dice Chakraborty. Durante los últimos dos años y medio, él y su colega Souvik Maiti habían estado trabajando en un sistema Cas9 que podría detectar la mutación en el gen que causa la anemia de células falciformes para el diagnóstico CRISPR en el punto de atención. Para probar su enfoque, viajaron a centros de salud remotos en el estado de Chattisgarh en India y recolectaron muestras de saliva de personas que se sabía que tenían anemia de células falciformes, así como de posibles portadores silenciosos de la mutación.
Como ellos estaban preparando la publicación de sus resultados en enero, golpe de COVID-19, y se preguntaban si podrían reutilizar la tecnología para detectar el SARS-CoV-2.
Comenzando de inmediato, dice Chakraborty, su equipo de graduados los estudiantes y posdoctorados trabajaron día y noche, y algunos colegas se enfermaron con el virus en el camino. En marzo, habían desarrollado un prototipo de diagnóstico y, en mayo, otorgaron la licencia de la tecnología a TATA Medical and Diagnostics Limited, que logró la aprobación regulatoria.
Feluda funciona convirtiendo primero el ARN viral de una muestra en ADN, y luego amplificar genes virales específicos a través de PCR, durante el cual coloca una etiqueta de biotina en los productos amplificados. Después de esto, la muestra se incuba en el mismo tubo de PCR con un complejo de ARN FnCas9guide etiquetado con fluorescencia, que busca estas secuencias. del SARS-CoV-2 y se engancha a ellos, creando un complejo más grande del FnCas9 fluorescente y la secuencia de ADN viral marcada con biotina. Luego, el técnico agrega un tampón y sumerge una tira de papel en el tubo. Las nanopartículas de oro en el papel reconocen la etiqueta fluorescente y todo el complejo fluye por la tira y se deposita en una línea de estreptavidina, que interactúa con la etiqueta de biotina en el ADN. La acumulación de las nanopartículas produce la señal visible.
Hay otras pruebas basadas en CRISPR para COVID-19, incluida una desarrollada por el MIT y la Universidad de Harvard, y estas emplean proteínas Cas12 o Cas13 para encontrar el virus.
Harikrishnan Jayamohan, un científico investigador de la Universidad de Utah que no participó en el trabajo, dice: Si Feluda funciona a gran escala en India, esta sería una buena alternativa a RT- PCR. Esto también sería un gran salto sobre las pruebas de antígenos, que son ampliamente utilizadas, baratas, rápidas y fáciles de usar, pero tienen una sensibilidad muy baja. Casi el 50 por ciento de los diagnósticos de COVID-19 en la India se realizan a través de pruebas de antígenos.
Feluda es bueno en ciertos aspectos, dice Rakesh Kumar Mishra, director del CSIR-Centro de Biología Celular y Molecular con sede en Hyderabad, quien fue no participó en la investigación de Feluda. Será particularmente útil en lugares remotos porque Feluda puede funcionar con una máquina de PCR simple y esa máquina puede alojarse en un centro de salud rural. Pero el valor real de una prueba de tira de papel es cuando se puede usar para autoevaluarse o en casa, dice Yadav, aunque Feluda aún no está listo para eso.
Esto es algo difícil en lo que estamos luchando , dice Mishra. Cualquier herramienta es una buena herramienta.
M. Azhar et al., Detección de nucleobase rápida y precisa mediante FnCas9, medRxiv, doi:10.1101/2020.09.13.20193581, 2020.