Nueva técnica CRISPR causa pocas mutaciones no deseadas en moscas de la fruta
Imagen de microscopio fluorescente de un ojo de Drosophila editado genéticamente con patrones de mosaico de pigmentaciónAnnabel Guichard/Universidad de California, San Diego
CRISPR-Cas9 revolucionado biología y salud. Secuestra el sistema de defensa inmunitario bacteriano para editar con precisión un genoma. Pero el método no es perfecto. Puede insertar secuencias de ADN no deseadas, eliminar segmentos por completo y mutar por error genes que no son el objetivo.
La investigación publicada hoy (1 de julio) en Science Advances informa que un CRISPR suave alternativo llamado CRISPR-Nickase puede editar el ADN de manera eficiente y segura.
CRISPR-Nickase aprovecha el hecho de que los humanos tienen dos copias de cada gen, uno de cada padre. Cas9, las tijeras moleculares que eliminan los genes diana, tiene dos sitios activos que cortan cada copia. Nickase es un mutante de Cas9 con un sitio desactivado, por lo que solo corta uno.
Los cortes únicos son útiles cuando solo una versión del gen es defectuosa, algo común en muchos trastornos genéticos. CRISPR-Nickase puede eliminar la copia defectuosa y la propia maquinaria de reparación del ADN de las células puede copiar la versión normal en su lugar. Esto difiere del CRISPR-Cas9 tradicional, donde se requiere una plantilla de ADN introducida experimentalmente para reparar el daño de un proceso de ruptura de doble cadena que puede ser propenso a errores, dice el coautor del estudio Ethan Bier, biólogo del desarrollo de la Universidad de California, San diego
Sin embargo, la reparación de muescas es un lugar común en las células. Cada vez que se copia o expresa un gen, la célula corta el ADN para desenrollarlo y lo repara para recondensarlo. Esto sucede miles y miles de veces al día, dice Bier, que ha fundado dos empresas basadas en la edición de genes CRISPR: Synbal Inc., que produce animales de investigación, y Agragene, que desarrolla aplicaciones para el control de plagas.
Debido a que las células reparan las muescas de forma natural, los investigadores plantearon la hipótesis de que CRISPR-Nickase podría ser una forma eficiente de editar copias individuales de un gen. En una investigación publicada por otros científicos, Nickase se ha mostrado prometedor en el esperma y los óvulos de la mosca de la fruta, que solo portan una copia de cada gen. Este estudio muestra que también puede funcionar en células somáticas, que portan dos.
Nadie esperaba que esto funcionara tan notablemente.
Ethan Bier, Universidad de California, San Diego
El equipo probó la nueva técnica CRISPR usándola para modificar el color de ojos en moscas de la fruta. El gen que seleccionaron codifica los ojos rojos cuando es funcional, pero las moscas mutantes criadas en laboratorio que diseñaron tenían dos copias defectuosas que en cambio codificaba para el color de ojos blanco.
Esas copias diferían en el lugar donde se produjo la mutación. La copia de la madre era funcional en el sitio uno pero mutaba en el sitio dos, mientras que la copia del padre funcionaba en el sitio dos y mutaba en el sitio uno. Los investigadores diseñaron CRISPR-Nickase para cortar el ADN en el sitio 1 paterno mutado y reemplazarlo con la copia funcional de ese sitio del gen materno. La copia paterna reparada entonces codificaría para la producción de pigmentos de ojos rojos, restaurando el color normal de los ojos. Cada ojo era un mosaico de rojo y blanco, donde el rojo indicaba una edición genética exitosa.
Los investigadores probaron el enfoque modificado contra CRISPR-Cas9 tradicional y descubrieron que Nickase superó a Cas9 a pasos agigantados. En moscas editadas con CRISPR-Cas9, un promedio de 2030 por ciento de cada ojo de mosca se puso rojo, pero CRISPR-Nickase tuvo una tasa de éxito de 5070 por ciento.
La coautora del estudio, Annabel Guichard, investigadora de CRISPR en la Universidad de California en San Diego, dice que se quedó atónita cuando miró por primera vez las moscas editadas que perforaban los ojos rojos. Ese fue un momento fantástico y mágico, dice ella.
No podía creerlo cuando [Guichard] me lo mostró, agrega Bier. Nadie esperaba que esto funcionara tan notablemente.
Además de ser eficiente, CRISPR-Nickase también presentaba un riesgo mutacional menor en comparación con CRISPR-Cas9. Cas9 causó mutaciones no deseadas en el sitio de edición el 66 por ciento de las veces. La tasa de mutación de Nickases fue solo del 0,7 por ciento, una disminución de cien veces.
Esto no incluye mutaciones fuera del objetivo en genes no objetivo. Según Bier, CRISPR-Cas9 no alcanza su objetivo entre el 1 y el 2 por ciento de las veces. Estas mutaciones fuera del objetivo son particularmente peligrosas porque accidentalmente podrían romper genes sanos y correr el riesgo de causar enfermedades como el cáncer. Nickase no causa ninguno.
Ver la nueva técnica limita las mutaciones fuera del objetivo CRISPR-Cas9
Es lo más limpio posible, dice Bier. Para una aplicación en el futuro en la que desee utilizarla para la terapia génica, eso es exactamente lo que desea. Sin mutaciones fuera del objetivo ni dentro del objetivo.
La tasa de mutación mínima en particular emociona a Vivian Vigliotti, quien investiga los servicios de salud y las necesidades de salud pública en el Sistema de Salud de Yale New Haven y no participó en el estudio. Creo que es maravilloso, dice Vigliotti, quien ha publicado sobre las aplicaciones de salud de CRISPR. Eso es realmente lo que buscaba.
Ben Ewen-Campen, un biólogo del desarrollo que estudia CRISPR en la Escuela de Medicina de Harvard, dice que el advenimiento de CRISPR-Cas9 fue como la explosión cámbrica de nuevas técnicas, lo que facilitó nuevos descubrimientos y generó potencial. aplicaciones La eficiencia con la que funciona CRISPR-Nickase fue el último hallazgo sorprendente que surgió de la rápida evolución de CRISPR-Cas9, dice.
Ver La adaptación de CRISPR a la edición del genoma gana el Premio Nobel de Química
Debido a que CRISPR-Nickase funciona en células adultas, los autores del estudio dicen que algún día podría ser útil para tratar enfermedades genéticas, especialmente aquellas como Huntington o ciertos tipos de cáncer donde una mala copia puede conferir enfermedades. Si la otra copia es funcional, CRISPR-Nickase podría reemplazar la versión enferma por la sana.
Está abriendo las puertas para CRISPR y para los aspectos maravillosamente esperanzadores que nosotros, como investigadores, hemos estado buscando, dice Vigliotti.
La técnica debe validarse en mamíferos antes de probarse en humanos y tal vez llegar a la clínica. Bier dice que es casi seguro que funcionará mejor en las moscas que en los mamíferos, porque los cromosomas de las moscas se alinean de modo que la plantilla de ADN esté cerca del sitio de reparación, pero las células de los mamíferos no están tan organizadas.
Sin embargo, si los investigadores pueden optimizar la técnica en mamíferos, las aplicaciones podrían ser de gran alcance. La carga molecular que lleva la tecnología CRISPR-Nickase podría llegar a regiones del cuerpo de difícil acceso, como el hígado y la retina.
Es difícil decir [cuáles son las aplicaciones] sin saber qué tan eficientes serán estos sistemas, dice Bier. Pero creo que quieres llegar a partes del cuerpo que son difíciles de reparar de otra manera.