Nuevo método de alto rendimiento amplía enormemente la visión de cómo las mutaciones afectan a las células
Crédito: DOI: 10.1038/s41587-021-01160-7
Hay millones de mutaciones y otras variaciones genéticas en el cáncer. Sin embargo, comprender cuál de estas mutaciones es un «conductor» impactante del tumor en comparación con un «pasajero» inocuo y qué le hace cada uno de los conductores a la célula cancerosa ha sido una tarea desafiante. Muchos estudios se basan en enfoques personalizados, lentos y específicos de genes que brindan vistas unidimensionales de los impactos funcionales más amplios de una mutación dada. Alternativamente, las predicciones computacionales pueden proporcionar información funcional, pero esos hallazgos luego deben confirmarse mediante experimentos.
Ahora, en un informe publicado en Nature Biotechnology, un equipo de investigación del Instituto Broad del MIT y Harvard ha presentado un método de alta resolución y escala masiva para evaluar funcionalmente un gran número de mutaciones codificantes de proteínas simultáneamente, uno que arroja resultados ricos información fenotípica y que potencialmente podría usarse para estudiar cualquier mutación en cualquier gen en el cáncer y quizás en otras enfermedades. Sus resultados, obtenidos a través de experimentos de prueba de concepto con líneas celulares de cáncer, también muestran que las mutaciones individuales pueden tener un espectro de efectos no solo en sus genes afectados, sino también en las vías moleculares y el estado celular en su conjunto, y agregan matices a la práctica aceptada desde hace mucho tiempo de dividir las mutaciones del cáncer en los llamados «impulsores» y «pasajeros».
«Cuando observa los datos genéticos de los tumores de los pacientes, ve que la mayoría de las mutaciones asociadas con el cáncer en realidad son bastante raros, lo que significa que tenemos pocos conocimientos sobre lo que hacen estas mutaciones», dijo Jesse Boehm del Programa de Cáncer de Broad, quien fue coautor principal del estudio con Aviv Regev, miembro del instituto central de Broad ahora en Genentech, un miembro del Grupo Roche. «Para que la medicina de precisión del cáncer se convierta en una realidad, necesitamos una comprensión firme de la función de cada mutación, pero un gran desafío ha sido definir un enfoque experimental que podría implementarse en el laboratorio a la escala requerida. Este nuevo método puede ser el herramienta que necesitamos».
El nuevo método, llamado fenotipado de impacto variante basado en la expresión de una sola célula (sc-eVIP), se basa en el enfoque Perturb-seqan desarrollado en 2016 por Regev y sus colegas para manipular genes y explorar las consecuencias de esas manipulaciones utilizando secuenciación de ARN unicelular de alto rendimiento y eVIP, un método también desarrollado en 2016 por Boehm y sus colegas para perfilar variantes de cáncer a baja escala utilizando mediciones de ARN. Si bien los ensayos Perturb-seq originalmente se basaron en CRISPR para introducir mutaciones en las células, el equipo de sc-eVIP adoptó un enfoque basado en la sobreexpresión, diseñando construcciones de genes con código de barras de ADN para cada mutación de interés e introduciéndolas en grupos de células de tal manera que las células expresaron los genes mutados a niveles más altos de lo normal.
Al registrar el perfil de expresión de cada célula perturbada mediante secuenciación de ARN de una sola célula, el equipo pudo identificar qué mutación portaba una célula determinada (según los códigos de barras únicos de las construcciones) y examinar el impacto más amplio de la mutación en la célula. estado general de la expresión. Este enfoque proporciona una vista muy detallada del impacto de una mutación en una variedad de vías y circuitos moleculares, y no necesita ser adaptado para cada nuevo gen estudiado.
«En cierto sentido, estamos usando el célula como un biosensor», dijo Oana Ursu, becaria postdoctoral en el laboratorio Regev, anteriormente dentro del Observatorio de Células Klarman de Broad y ahora en Genentech, y coautora del estudio con JT Neal, líder de grupo sénior en Broad’s Cancer Programa. «Al observar los cambios de expresión que tienen lugar cuando sobreexpresamos un gen mutado, podemos saber si tiene un impacto significativo. Pero también podemos comparar y categorizar las variantes en función de los cambios que desencadenan y buscar patrones en la biología. afectan».
«La mayoría de las tecnologías desarrolladas para interpretar las variantes de codificación hasta ahora han sido muy escalables, pero han tenido lecturas relativamente simples como la viabilidad celular o tal vez han observado un solo rasgo. Su contenido de información ha han sido bajos, y se necesita mucho trabajo para optimizarlos», dijo Neal. «Con sc-eVIP, hemos diseñado un enfoque integral que es de alto rendimiento y rico en información, lo que podría ser una gran ayuda para los estudios de variante a función a gran escala».
Para probar sc- Para aprovechar el potencial de eVIP, el equipo eligió estudiar TP53, el gen mutado con mayor frecuencia en el cáncer, y KRAS, que codifica un oncogén clave responsable del crecimiento anormal de muchos tipos de cáncer. Neal, Ursu y sus colaboradores generaron construcciones que contenían 200 mutaciones conocidas de TP53 y KRAS (incluidas las mutaciones asociadas con el cáncer y las mutaciones de control que se sabe que no afectan la función de los genes) y las introdujeron en 300 000 células de cáncer de pulmón y capturaron el perfil de expresión individual de cada célula. Con base en esos perfiles, el equipo clasificó cada mutación como «de tipo salvaje» (es decir, funcionalmente indistinguible del gen no mutado) o «supuestamente impactante», a partir de ahí definiendo aún más las mutaciones en función de si redujeron o mejoraron la función del gen. .
Los perfiles también revelaron el impacto más amplio de cada mutación en el estado celular, en función de cómo cambió la actividad de una variedad de vías en células individuales. Por ejemplo, los datos de sc-eVIP revelaron mutaciones de KRAS que caen a lo largo de un continuo en la forma en que impactan el estado celular a nivel de la población, desde no tener impacto hasta influir en cambios sutiles en la abundancia celular hasta causar la activación o represión total de vías clave en la mayoría. de células Estos hallazgos sugieren que diferentes mutaciones dentro del mismo gen pueden influir en el estado celular a lo largo de un espectro de impacto.
«La comunidad del cáncer ha adoptado durante mucho tiempo un marco conceptual binario de mutaciones ‘conductoras’, que promueven el desarrollo y la progresión del cáncer, frente a mutaciones ‘pasajeras’, que son completamente inertes y simplemente surgieron en el camino «, señaló Boehm. «Estos hallazgos iniciales sugieren que, biológicamente, esas categorías son probablemente demasiado simplistas, que en realidad hay un continuo de impacto funcional desde inerte hasta completamente tumorigénico».
Si bien el equipo se centró en los genes y mutaciones asociados con el cáncer para este estudio , observaron que sc-eVIP es independiente del gen, altamente escalable y que el uso de la secuenciación de ARN de una sola célula como lectura ofrece un enfoque eficiente y generalizable para producir datos fenotípicos ricos. También calcularon que debería ser posible caracterizar a fondo la mayoría de las mutaciones con solo 20 a unos pocos cientos de células. Con base en esos números, es posible que sc-eVIP genere un primer borrador de mapa funcional de más de 2 millones de variantes en aproximadamente 200 genes de cáncer conocidos con 71 millones de células.
«Si podemos mapear dónde encaja cada variante asociada con el cáncer en el continuo de impacto en una variedad de cánceres y tipos de células», dijo Boehm, «tendremos una mejor comprensión de cómo la interacción de variantes afecta el estado celular, que a su vez afecta el desarrollo, el crecimiento y la respuesta del cáncer. Tal conocimiento representaría un verdadero avance hacia la medicina de precisión del cáncer».
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¿Más de 60 años? Tiene miles de millones de células potencialmente cancerígenas. Más información: Oana Ursu et al, fenotipado masivo en paralelo de variantes de codificación en el cáncer con Perturb-seq, Nature Biotechnology (2022). DOI: 10.1038/s41587-021-01160-7 Información de la revista: Nature Biotechnology
Proporcionado por Broad Institute of MIT y Harvard Cita: Nuevo método de alto rendimiento enormemente amplía la vista de cómo las mutaciones afectan a las células (21 de enero de 2022) recuperado el 29 de agosto de 2022 de https://medicalxpress.com/news/2022-01-high-throughput-method-greatly-view-mutations.html Este documento está sujeto a derechos de autor. Aparte de cualquier trato justo con fines de estudio o investigación privados, ninguna parte puede reproducirse sin el permiso por escrito. El contenido se proporciona únicamente con fines informativos.