Desarrollo de ensayos serológicos para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2

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Aproximadamente cuatro meses después de la descripción inicial de los casos de neumonía atípica en Wuhan, China, en diciembre de 2019, el COVID-19 se había convertido en un gran amenaza de pandemia. Para el 12 de abril de 2020, alrededor de la mitad de la población mundial estaba confinada, con 1,8 millones de casos diagnosticados oficialmente. Científicos del Institut Pasteur, el CNRS, Inserm y la Universit de Paris realizaron un estudio piloto para evaluar la confiabilidad de varias pruebas de laboratorio con el objetivo de comprender mejor el perfil de las respuestas de anticuerpos al SARS-CoV-2 y cómo el virus se está extendiendo entre la población.

Se desarrollaron y evaluaron cuatro pruebas para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2, así como dos pruebas para la detección de anticuerpos neutralizantes. Estas pruebas, conocidas como ensayos de laboratorio, son una primera etapa en la investigación epidemiológica sobre el COVID-19. Los resultados de este estudio se publicaron en línea en medRxiv el 24 de abril de 2020 y luego en Science Translational Medicine el 17 de agosto de 2020.

Evaluación de la prevalencia de casos asintomáticos y sintomáticos de infección por SARS-CoV-2 y su perfil de respuesta de anticuerpos es una parte vital de los esfuerzos para contener el brote y arrojar luz sobre cómo se está propagando el virus.

Las pruebas de PCR se utilizan actualmente ampliamente en Francia y en todo el mundo, incluso por el Institut Pasteur (el Instituto Nacional de Centro de Referencia de Virus Respiratorios, en adelante CNR), para el diagnóstico de la COVID-19 y para la detección y cuantificación del ARN del SARS-CoV-2. Estas pruebas virológicas son esenciales para identificar y controlar a las personas con infección activa.

También se utilizan varios ensayos serológicos. Hay dos tipos:

• Ensayos de detección de anticuerpos, que muestran si un individuo ha desarrollado anticuerpos contra las proteínas del SARS-CoV-2 y, por lo tanto, contrajo previamente el virus.
• Ensayos de neutralización , que determinan si un individuo tiene anticuerpos neutralizantes y, por lo tanto, está inmunizado contra el virus.

La importancia de las pruebas confiables

La confiabilidad de estas pruebas es crucial. Varios equipos del Institut Pasteur, el CNRS, el Inserm y la Universit de Paris se propusieron desarrollar ensayos serológicos y realizaron un estudio piloto para evaluar la fiabilidad de cuatro ensayos de detección midiendo los niveles de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. También desarrollaron dos nuevos ensayos de detección, dándoles un punto adicional de comparación. Se tomaron grupos de muestras de sangre de diferentes categorías de individuos. Estos grupos, utilizados para evaluar los ensayos, se pueden desglosar de la siguiente manera:

• muestras de 400 individuos pre-pandemia (2017-2019), utilizadas como muestras comparativas para establecer la especificidad de los ensayos al asegurar que no hubo o hubo muy pocos «falsos positivos»;
• muestras de 51 pacientes con COVID-19 con formas graves o críticas, del Hospital Bichat en París. Estas muestras determinaron la sensibilidad de los ensayos y permitieron a los científicos estudiar la cinética de la respuesta de anticuerpos;
• muestras de 209 personas con síntomas leves (como fiebre o tos) tomadas en el departamento de Oise el 3 de marzo y 4, 2020;
• muestras de 200 donantes de sangre asintomáticos en Oise tomadas entre el 20 y el 24 de marzo de 2020.

Resultados de seroprevalencia

Seropositividad ( la presencia de anticuerpos) se detectó en el 32% de los individuos con signos leves compatibles con COVID-19 en los 15 días previos a la toma de muestras, y en el 3% de los donantes de sangre asintomáticos.

Tiempo de respuesta del anticuerpo

Los científicos determinaron el tiempo de respuesta de los anticuerpos en personas hospitalizadas con COVID-19. Los anticuerpos aparecieron de 5 a 6 días después de los primeros síntomas, con actividad neutralizante después de 7 a 14 días.

Esta línea de tiempo probablemente sea más larga en individuos levemente sintomáticos o asintomáticos, y los títulos de anticuerpos (concentración) probablemente sean más bajos.

Descripción y evaluación de los ensayos

Los equipos de investigación diseñaron cuatro ensayos de laboratorio para evaluar los niveles de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en suero humano.

Ensayos ELISA: Los dos ensayos ELISA son ensayos convencionales basados en la proteína N de longitud completa del SARS-CoV-2 (ELISA N) o el dominio extracelular de la proteína del pico del virus (S).

Ventajas: estos ensayos son basado en una técnica que se puede transponer fácilmente y se utiliza en kits comerciales. El ensayo ELISA S fue ligeramente más sensible que el ensayo ELISA N.

Para ambos ensayos, se planteó la cuestión de cómo podrían usarse a gran escala o comercializarse, ya que actualmente están pruebas de la casa. Ya se han comercializado ensayos basados en un principio similar y actualmente el CNR los está evaluando.

El CNR evalúa el rendimiento de los ensayos comerciales utilizando muestras de suero determinadas como negativas o positivas para el SARS-CoV-2. anticuerpos sobre la base de al menos dos de los ensayos serológicos desarrollados en el Institut Pasteur.

Ensayo S-Flow: este ensayo detecta la proteína del pico del SARS-CoV-2 en su conformación natural, en la superficie celular . Es muy sensible y específico. Los resultados fueron similares a ELISA S, con mayor sensibilidad para niveles bajos de anticuerpos. Pero el ensayo requiere un equipo especializado (un citómetro de flujo) que está menos disponible que los lectores de placas que generalmente se usan en los laboratorios médicos. Esto lo hace más adecuado para su uso en investigación epidemiológica en lugar de pruebas de diagnóstico a gran escala.

Ensayo LIPS: este ensayo de «inmunoprecipitación» utiliza una técnica diferente de las otras pruebas y detecta anticuerpos que se unen al SARS-CoV- 2 Proteínas N o S o sus subdominios. La prueba proporciona un perfil detallado de las regiones de proteínas virales a las que se dirige la respuesta de anticuerpos. Por lo tanto, el ensayo utiliza varios «antígenos objetivo» y la sensibilidad de la prueba varía según el antígeno detectado. Para este estudio se utilizaron parte de N y parte de S (S1). Este ensayo también se puede usar en su forma actual en la mayoría de los animales.

Los equipos de investigación también desarrollaron dos ensayos para detectar anticuerpos neutralizantes en muestras de suero de individuos infectados, uno que usa el virus infeccioso SARS-CoV-2 y que requieren acceso a un laboratorio BSL3, y uno basado en un «pseudovirus» que se puede usar sin necesidad de una instalación BSL3.

El ensayo de neutralización con SARS-CoV-2 infeccioso es más complicado de implementar ya que el virus debe manipularse en un laboratorio BSL3. Utiliza una dosis fija del virus que destruye el 100% de las células. Después de mezclarlo con diferentes diluciones de suero, los científicos observan si la presencia de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 es suficiente para neutralizar el virus e inhibir la multiplicación viral, evitando así la destrucción celular.

Los equipos de investigación también desarrollaron un ensayo de neutralización conocido como Lenti S, basado en un pseudovirus no infeccioso en lugar del virus SARS-CoV-2. Este ensayo no requiere contención en un laboratorio de bioseguridad, lo que facilita su implementación a gran escala.

A diferencia de los ensayos tipo ELISA, que detectan anticuerpos, un ensayo de neutralización mide la capacidad de los anticuerpos para bloquear la entrada de el virus en las células. Por lo tanto, puede determinar si un individuo tiene anticuerpos capaces de limitar la multiplicación del virus y es probable que confiera protección contra una mayor infección por SARS-CoV-2. Los equipos de investigación están ansiosos por adaptar este ensayo para que pueda usarse para pruebas de alto rendimiento. Se necesitará más investigación para determinar la cantidad de anticuerpos neutralizantes que probablemente confieran protección y su persistencia en el tiempo.

Correlación entre los ensayos

Para evaluar la fiabilidad comparativa de los ensayos, el los equipos de investigación los compararon utilizando tres cohortes.

En pacientes hospitalizados, se obtuvo un número similar de casos positivos con los ensayos serológicos basados en N y S; la aplicación diagnóstica del ensayo para detectar anticuerpos anti-S1 fue menos sensible, siendo el objetivo de este último investigar una correlación con la protección.

Con la cohorte de individuos sintomáticos de Oise, el S-Flow y ELISA Los ensayos S y la combinación LIPS N+S1 proporcionaron resultados muy similares y niveles de detección más altos que con las otras pruebas. En los donantes de sangre solo se detectaron casos positivos con los ensayos S-Flow y ELISA S.

En conclusión:

1. Los equipos de investigación compararon el rendimiento de cuatro ensayos de detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. En general funcionaron muy bien, con diferencias de sensibilidad según la prueba y sobre todo los antígenos a los que se dirigieron.

2. Con respecto a los ensayos de detección de anticuerpos neutralizantes, el ensayo de neutralización de pseudovirus es simple y robusto pero requiere instalaciones de cultivo celular y equipo especial. Los ensayos serológicos se utilizan para estimar el nivel de anticuerpos que se unen al virus en lugar de anticipar su funcionalidad.

3. Actualmente, los científicos están estableciendo correlaciones para poder estimar qué muestras de sangre tienen capacidad neutralizante en función de los niveles de anticuerpos que se unen a diferentes partes del virus.

4. Es probable que la presencia de anticuerpos neutralizantes en la sangre indique protección contra una infección adicional, particularmente si el título es alto, pero esto aún no se ha demostrado formalmente.

5. Las pruebas serológicas se pueden utilizar en la investigación epidemiológica para determinar la seroprevalencia entre grupos específicos.

6. Hubo circulación significativa del virus dentro del grupo de primeros casos en Oise: el 32% de las personas con signos clínicos moderados compatibles con COVID-19 tenían anticuerpos.

7. Los resultados de las pruebas realizadas en individuos asintomáticos dependieron de los grupos estudiados y su ubicación. Por ejemplo, de las 200 pruebas realizadas en donantes de sangre asintomáticos en Oise (no se permite donar sangre a las personas que presentan signos recientes), el 3 % dio positivo.

«Estos ensayos se utilizan para detectar la seroprevalencia en estudios epidemiológicos». estudios y también para diagnosticar individuos. También son muy útiles para caracterizar completamente los paneles de suero al evaluar las pruebas comerciales. Este estudio involucró a varios equipos del Institut Pasteur, trabajando en cooperación con médicos y virólogos de la Red de Hospitales Públicos de París (AP-HP) e Inserm, epidemiólogos y el Servicio Francés de Sangre (EFS). Nos gustaría pensar en los pacientes y voluntarios que donaron sangre para este estudio», enfatizan los coautores del estudio Marc Eloit, Hugo Mouquet, Olivier Schwartz y Sylvie van der Werf.

«Los ensayos ELISA N y ELISA S son de especial interés en el contexto actual. En el Institut Pasteur se podrían realizar miles de pruebas cada semana y compartir la técnica con h otros laboratorios», explica Sylvie van der Werf, directora del Centro Nacional de Referencia para Virus Respiratorios y última autora conjunta del estudio.

«Los ensayos tipo LIPS tienen la misma sensibilidad que los ensayos tipo ELISA para el mismo antígeno y son útiles para estudiar en detalle la probabilidad de protección contra más infecciones en cohortes de varios miles de muestras de suero para determinar qué antígenos son óptimos para pruebas de alto rendimiento, un enfoque que será crucial para gestionar la flexibilización de las medidas de bloqueo. Desde este trabajo, también hemos extendido el uso del ensayo LIPS a la detección de la infección por coronavirus estacionales y su papel en la protección o facilitación de la infección por SARS-CoV-2”, dice Marc Eloit, Jefe del Laboratorio de Descubrimiento de Patógenos. y último autor conjunto del estudio.

«Desde el comienzo del estudio en marzo de 2020, el ensayo S-Flow se ha utilizado para estudiar el alcance de la respuesta humoral en personas PCR+ con síntomas leves. Actualmente estamos evaluando la duración de esta respuesta. Estamos analizando muestras de personas convalecientes recolectadas en diferentes momentos posteriores al inicio de los síntomas», dice Olivier Schwartz, Jefe de la Unidad de Virus e Inmunidad y último autor conjunto del estudio.

Explore más

Siga las últimas noticias en el brote de coronavirus (COVID-19) Más información: Ludivine Grzelak et al. Una comparación de cuatro ensayos serológicos para detectar anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en muestras de suero humano de diferentes poblaciones, Science Translational Medicine ( 2020). DOI: 10.1126/scitranslmed.abc3103

www.medrxiv.org/content/10.110 … 020.04.21.20068858v1 Información de la revista: Science Translational Medicine