El ARN glicosilado recién descubierto está en todas las células: estudio

ARRIBA: Los glicoARN se unen a los glicolípidos y las glicoproteínas como parte del recubrimiento de azúcar de la célula. RYAN FLYNN

La aparición de los ácidos nucleicos y la de las proteínas A veces se les ha llamado la primera y la segunda revolución de la evolución, ya que hicieron posible la vida tal como la conocemos. Algunos expertos argumentan que la glicosilación, la adición de glucanos a otros biopolímeros, debería considerarse la tercera, porque permitió a las células construir innumerables formas moleculares a partir de los mismos planos de ADN. Durante mucho tiempo se ha creído que solo las proteínas y los lípidos reciben estas construcciones de carbohidratos, pero un artículo del 17 de mayo en Cell que se basa en una preimpresión de bioRxiv de 2019 postula que los ARN se pueden glicosilar , también, y estos ácidos nucleicos recubiertos de azúcar parecen localizarse en las membranas celulares.

Anna-Marie Fairhurst, que estudia la autoinmunidad en la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur, describe el estudio como emocionante. Obviamente, es la primera vez que vemos esto con el ARN, dice, y agrega que la diversidad de métodos utilizados para demostrar la presencia de glicoARN hace que los hallazgos sean especialmente sólidos.

Lo que realmente la intriga es las partes presentes en el artículo Cell  de 2021 que no están en la preimpresión de 2019, en particular, que los glicoARN parecen terminar predominantemente en la membrana externa de las células. Allí, pueden unirse a dos tipos de lectinas de tipo inmunoglobulina que se unen al ácido siálico (Siglecs), una familia de receptores inmunitarios implicados en varias enfermedades, incluido el lupus eritematoso sistémico (LES). Todo esto sugiere que los glicoARN pueden desempeñar un papel en la señalización inmunitaria. Es una era de la ciencia realmente emocionante, dice Fairhurst.

Ir en contra del dogma de la glicobiología

Ryan Flynn, el primer autor del nuevo artículo y biólogo del ARN en la Universidad de Harvard y el Hospital Infantil de Boston. , dice que hizo el sorprendente descubrimiento de los glicoARN mientras trabajaba en el laboratorio de la bióloga química Carolyn Bertozzi en la Universidad de Stanford. Bertozzi dice que al principio se mostró escéptica, pero se convenció después de pensar en cómo sus propias suposiciones podrían estar dando forma a sus puntos de vista. Aportamos a cada experimento todo este sesgo inconsciente, explica, y una vez que volvió a examinar el suyo, no encontró ninguna razón para pensar que los glicoARN no deberían existir. Estas son moléculas antiguas, dice ella. No hay razón para simplemente suponer que no habrían encontrado una manera de conectarse y crear una nueva biología.

Estas son moléculas antiguas. . . No hay razón para simplemente suponer que no habrían encontrado una forma de conectarse y crear una nueva biología.

Carolyn Bertozzi, Universidad de Stanford

Da la casualidad de que Flynn se propuso anular el dogma de la glicosilación cuando se unió al laboratorio de Bertozzi como postdoctorado en 2017, aunque no sucedió como esperaba. Al principio, explica, tenía el ojo puesto en una peculiar vía de glicosilación de proteínas citosólicas porque se había dado cuenta de que una de sus enzimas clave tiene un dominio de unión al ARN. Si hay una enzima de glicosilación con el potencial de unirse al ARN, y su funcionamiento en el citosol donde tienden a estar los ARN, razonó, también podría estar pegando azúcares a los ARN.

Para buscar el existencia de estas estructuras, era realmente importante que yo tuviera acceso a cosas que no dependieran de altas temperaturas, y que no dependieran de metales que de otro modo podrían degradar el ARN, dice, y eso es exactamente lo que el laboratorio de Bertozzi tenía para ofrecer. Es pionera en el campo de la química bioortogonal, cuyo objetivo es desarrollar métodos químicos para rastrear biomoléculas en sus entornos nativos. Su laboratorio estaba repleto de reactivos que marcan tipos específicos de glicanos sin dañar otras moléculas ni desencadenar reacciones secundarias.

Ver Carolyn Bertozzi: Glycan Chemist

Flynn se puso a trabajar estos compuestos de marcaje de glicanos a las células HeLa y luego aislaron el ARN de ellas para ver si quedaba alguna señal de glicanos después de haber eliminado todas las proteínas y los lípidos. Dice que pensó que podría ver una señal cuando etiquetó el tipo de glicanos utilizados en esa vía de glicosilación citosólica.

Sin embargo, meses de experimentos no lograron respaldar esa hipótesis.

En cambio, algo extraño seguía ocurriendo con lo que se suponía que era un control negativo: células tratadas con ManNAz, un precursor marcado con azida para los sialoglicanos, un grupo de glicanos conocidos por su papel como modificadores de las proteínas y los lípidos secretores y de la superficie celular. Una vez que las células tuvieron la oportunidad de incorporar ManNAz, se lisaron con TRIzol, que rompe los componentes celulares sin dañar los ARN, y las proteínas supervivientes se cortaron con proteasas. La idea era que no hubiera señal de azida al final, ya que los sialoglicanos se unen a proteínas y lípidos en el retículo endoplásmico y Golgi, donde los ARN no tienen nada que hacer. Yo estaba como, no hay forma de que un reactivo que marca los sialoglicanos termine marcando un ARN, incluso un glicoARN, dice Bertozzi, pero esos experimentos dieron señales positivas a Flynn de manera consistente.

Entonces, el equipo profundizó más. Los glicoARN que encontró el equipo no solo contenían este subgrupo específico de glucanos, sino que parecían consistir en gran medida en YRNA, una familia de pequeños ARN no codificantes altamente conservados cuyas funciones celulares aún no están claras, aunque estudios previos han sugerido que pueden desempeñar un papel en la oncogénesis. y autoinmunidad. La especificidad tanto de los glicanos como del tipo de ARN implicados apunta fuertemente a que se unen entre sí con una enzima, dice Bertozzi.

Véase Los glicanos pueden unirse al ARN, sugieren los hallazgos iniciales

Además, una vez que los investigadores comenzaron a buscarlos, encontraron estos glicoARN en numerosas líneas celulares establecidas, incluidas las derivadas del cáncer, como las células HeLa y T-ALL 4118, así como las células CHO y H9 derivadas de células madre. Incluso pudieron detectar glicoARN en células de hígado y bazo extraídas de ratones vivos que recibieron inyecciones intraperitoneales de ManNAz, lo que sugiere que los glicoARN están en todas partes.

Para 2019, los miembros del equipo sintieron que tenían suficientes datos de apoyo para enviar sus hallazgos, por lo que pusieron la versión preliminar en bioRxiv. Causó un gran revuelo en la comunidad científica, pero sin la revisión por pares, algunos se mantuvieron escépticos. Ahora, después de más experimentos y un riguroso proceso de revisión, el equipo dice que sus datos se han vuelto aún más convincentes. conjugado de glicano, dice Laura Kiessling, investigadora de biología química que estudia los carbohidratos en el MIT y no participó en el estudio. Sin embargo, quedan grandes preguntas, incluido qué hacen estos glicoARN y cómo se forman. Por ejemplo, no está claro exactamente cómo los ARN y los glicanos están físicamente conectados entre sí, señala, y sin esa información, no está del todo convencida de que la unión se produzca enzimáticamente.  

Flynn y Bertozzi sugieren que los ARN se glicosilan de la misma manera que las proteínas, y que incluso requiere algunas de las mismas proteínas. Como se señaló en la preimpresión original, cuando inhibieron las enzimas clave involucradas en la glicosilación, los glicoARN desaparecieron de manera dependiente de la dosis. De manera similar, las líneas celulares diseñadas para tener errores en la glicosilación de proteínas produjeron muy poco glicoARN. Pero que los ARN sean glicosilados por la misma vía que las proteínas sería extraño, dice Kiessling, señalando que los múltiples pasos de glicosilación solo ocurren después de verificar el plegamiento adecuado de las proteínas. Es difícil para mí imaginar exactamente cómo ocurriría eso con el ARN.

Los investigadores incluso pudieron detectar glicoARN en células de hígado y bazo extraídas de ratones vivos, lo que sugiere que los glicoARN están en todas partes.

Fairhurst dice que también quiere saber más sobre la vía de síntesis. También tiene muchas otras preguntas, lo que dice que es una buena señal. Un artículo realmente bueno y emocionante deja muchas más preguntas que respuestas, señala.

Si bien la versión preliminar de 2019 planteó muchas de estas preguntas, algunas son exclusivas de los nuevos datos presentados en la Célula versión. Quizás la mayor adición al trabajo fue el descubrimiento de dónde estos glicoARN pasan su tiempo atrapados en el exterior de las células, explica Flynn. El equipo demostró esto al exponer brevemente algunas células HeLa marcadas con ManNAz a una enzima que puede escindir los glucanos de ácido siálico de la superficie celular. Si los glicoARN estuvieran en el exterior, se cortarían y la cantidad total de glicoARN restantes disminuiría. Y eso es exactamente lo que encontraron: la señal de glicoARN comenzó a disminuir después de tan solo 20 minutos de incubación con la sialidasa y se redujo en más del 50 por ciento después de una hora, lo que el equipo sugiere significa que más de la mitad de las células son glicoARN. pegado en su membrana externa.

Los investigadores probaron aún más la hipótesis de la localización extracelular al marcar las células vivas con un anticuerpo que se une al ARN de doble cadena. Alrededor de una quinta parte de un cultivo de células HeLa dio positivo para la tinción de anticuerpos, y la etiqueta fue sensible al tratamiento con RNasa, lo que respalda aún más la idea de que los glicoARN están realmente presentes en la membrana celular externa. Eso abre muchas ideas y muchas posibilidades, funcional y mecánicamente, de lo que podrían estar haciendo, dice Flynn.

Una de esas posibilidades es que los glicoARN están involucrados en la comunicación de célula a célula. señalización, especialmente en un contexto inmunológico, ya que es una función conocida de los glicolípidos y glicoproteínas de membrana. Bertozzi ya había estado investigando los ligandos de Siglecs, un grupo de receptores de unión al azúcar que modulan las reacciones inmunitarias, por lo que el equipo decidió ver si alguno de ellos se unía a los glicoARN. Primero trataron las células HeLa con diferentes Siglecs para demostrar que los receptores se unían normalmente y luego trataron las células con RNasa. Y he aquí que la unión de Siglec-11 y Siglec-14 cayó precipitadamente, lo que sugiere que la enzima cortadora de ARN escindió sus ligandos de la superficie.

Bertozzi dice que el experimento indicó que los glicoARN son ligandos para Siglec -11 y Siglec-14, y si es así, serían los primeros identificados para Siglec-11. que estos glicoARN puedan interactuar con ellos es muy emocionante, dice. Mi deseo inmediato es ver si están asociados con enfermedades, particularmente en LES, agrega.

¿GlicoARN y enfermedad?

Lan Lin, bióloga de ARN de la Universidad de Pensilvania y Childrens Hospital of Philadelphia, dice que encontró la preimpresión de 2019 tan interesante que solicitó y recibió una subvención piloto del Consorcio Frontiers in Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) para estudiar los roles que los glicoARN pueden desempeñar en CDG, un grupo de enfermedades congénitas raras. afecciones derivadas de mutaciones en las vías de glicosilación de proteínas. Debido a que la glicosilación del ARN puede estar relacionada con la glicosilación de proteínas, le dice a The Scientist, era racional o razonable que [mis colegas y yo] planteáramos la hipótesis de que. . . algunos de estos pacientes pueden tener diferencias en el glicoARN en su sistema y, por lo tanto, las condiciones de CDG podrían usarse para examinar las funciones potenciales de los glicoARN.

Hasta ahora, dice, su equipo no ha detectado ningún diferencias consistentes en glicoARN entre las células de controles sanos y pacientes CDG. Ella dice que puede deberse a que las diferencias son más cualitativas que cuantitativas, como alteraciones en los azúcares mismos o el subconjunto de ARN que están glicosilados. Alternativamente, señala, los nuevos datos en el artículo de Cell de 2021 pueden proporcionar una explicación: la localización de la membrana de los glicoARN no estaba en la preimpresión, por lo que tal vez estemos buscando en el lugar equivocado, reflexiona.

También es posible que se necesiten nuevos métodos para detectar diferencias de glicoARN entre células. Ella señala que una de las principales limitaciones del estudio es que el método de etiquetado de ManNAz no se puede aplicar fácilmente a muestras de sangre o tejidos humanos preservados.

Fairhurst dice que le gustaría ver más trabajo en cultivos celulares primarios. en lugar de los inmortalizados, especialmente los subtipos de leucocitos, donde uno podría esperar diferencias pronunciadas si los ARN tienen un papel en la inmunidad. Por ejemplo, dice que le gustaría ver si, en personas con condiciones como LES, diferentes tipos de células tienen menos o más glicoARN, aunque obviamente, esos experimentos son realmente desafiantes.

Al ver estos grandes hitos es asombroso

Anna-Marie Fairhurst,  Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur 

Aun así, dice, ver estos grandes hitos es asombroso. 

Kiessling dice que cree que los glicoARN podrían ser muy importantes en el campo de la glicobiología. Su laboratorio se enfoca en cómo las proteínas de unión a carbohidratos pueden leer los glucanos en las superficies de las células, explica, por lo que estos glicoARN podrían ser un nuevo tipo de información para leer. Lin señala que los hallazgos son especialmente impactantes para los investigadores del ARN, ya que sugieren un tipo completamente nuevo de modificación postranscripcional que necesita investigación. Debido a que el glicoARN se encuentra en la intersección de la glicobiología, la inmunología y la biología del ARN, dice Bertozzi, el descubrimiento de Ryan ha unido estos mundos dispares.

Flynn y Bertozzi dicen que esperan comenzar a responder algunas de las muchas preguntas. que quedan, incluida la forma en que los glucanos se unen a los ARN y cómo y dónde sucede eso. La parte más emocionante, dicen, serán las investigaciones sobre lo que hacen los glicoARN.

R. Flynn et al., Los ARN pequeños se modifican con N-glucanos y se muestran en la superficie de las células vivas, Cell, doi:10.1016 /j.cell.2021.04.023, 2021.