Encontrar potenciadores con CRISPR
Estructura cristalina de Cas9 unida a DNAWIKIMEDIA, CAS9 WIKI PROJECTMientras varios grupos están trabajando para aplicar el sistema CRISPR/Cas9 con fines clínicos, algunos están utilizando la herramienta para abordar cuestiones fundamentales sobre biología. Reuven Agami, profesor de genética en el Instituto del Cáncer de los Países Bajos en Ámsterdam, y sus colegas aplicaron recientemente CRISPR para buscar elementos potenciadores de la regulación en todo el genoma. Dirigieron la nucleasa Cas9 a elementos potenciadores previamente identificados, secuencias de ADN de unión al factor de transcripción que regulan distalmente la expresión génica, de dos factores de transcripción: p53 y el receptor de estrógeno alfa (ERα), que con frecuencia están mutados y desregulados en el cáncer. Los hallazgos del equipo, publicados hoy (11 de enero) en Nature Biotechnology, destacan secuencias potenciadoras clave de estas dos proteínas y demuestran la utilidad de CRISPR para el estudio sistemático de secuencias de ADN no codificantes.
Otros dos grupos habían utilizado previamente CRISPR para crear bibliotecas knockout de genes codificadores de proteínas en células humanas…
Este [enfoque basado en CRISPR] es realmente necesario porque es bastante difícil de evaluar la función de los elementos reguladores en situaciones endógenas, sin usar ensayos de indicadores, dijo Ramin Shiekhattar, quien estudia el epigenoma humano y las bases moleculares del cáncer en la Facultad de Medicina Miller de la Universidad de Miami, pero no formó parte del trabajo actual.
Se sabe que muchas mutaciones en los genes que codifican proteínas contribuyen al crecimiento del cáncer. Encontrar mutaciones en regiones no codificantes que afecten el crecimiento del cáncer ha sido un reto.
El correcto funcionamiento de los potenciadores es esencial para mantener un tejido sano y hay muchos indicios de que su mal funcionamiento en el cáncer puede provocar cambios en la expresión génica que favorecen desarrollo tumoral, dijo Agami. Lo que necesitábamos era una herramienta para identificar qué potenciadores son potencialmente importantes en el cáncer porque es difícil saber si una mutación no codificante en un tumor es la causa del crecimiento del tumor o una consecuencia del mismo.
El equipo de Agamis construyó una biblioteca de ARN de guía única CRISPR dirigida a 685 sitios genómicos, lo que representa alrededor del 90 por ciento de los elementos potenciadores conocidos de p53. Más allá del ARN de guía única, las células humanas utilizadas para la detección también expresaron p53 y un oncogén inducible, Hras. La inducción de la expresión aberrante de Hras provoca senescencia celular mediada por p53. Pero si el equipo usó CRISPR para eliminar un potenciador esencial para la función p53, la expresión de Hras permitió que las células siguieran creciendo sin inhibiciones. De esta manera, el equipo identificó tres elementos potenciadores importantes para la función de p53, incluidos dos justo antes de p21, también conocido como inhibidor 1A de la cinasa dependiente de ciclina. Aparentemente, p53 necesita unirse a estos dos sitios aguas arriba del gen p21 para activar completamente la senescencia celular.
En una segunda pantalla, los investigadores construyeron una biblioteca de ARN de guía única diferente dirigida a 73 sitios de unión potenciadores de ER. Identificaron tres secuencias potenciadoras que, cuando se anulan en las líneas celulares de cáncer de mama humano, dependen de la expresión de ER para el crecimiento.
Es emocionante ver que esta estrategia funcione, David Root, director de Broad Institutes Genetic Perturbation Plataforma que no participó en el trabajo, escribió en un correo electrónico a The Scientist. A continuación, será útil aprender qué tan completo es este enfoque. ¿Qué fracción de todos los sitios candidatos se analizó con precisión con un par de sgRNA [ARN de guía única] cada uno?
Habiendo clasificado los elementos de ADN necesarios para la actividad del RE, el equipo de Agamis planea secuenciar estos loci en muestras de tumores de mama de pacientes que desarrollaron resistencia a la terapia con antiestrógenos. Nos gustaría saber si estas muestras de tumores han acumulado mutaciones en estos elementos potenciadores que pueden explicar por qué los tumores se volvieron resistentes a la terapia, dijo.
Una extensión útil del estudio actual, dijo Shiekhattar, sería para observar los potenciadores activos en contextos específicos, como momentos precisos durante el desarrollo y en tipos de tumores específicos. No podemos recapitular del todo lo que sucede in vivo con el cultivo de tejidos, dijo. Ahora, podríamos estar usando CRISPR en modelos de ratones.
Lo que CRISPR/Cas9 ha hecho por nosotros es hacer que las mutaciones específicas sean realmente triviales, dijo Moens. Aplicar esto a [secuencias no codificadas] es inteligente, y me sorprende que haya funcionado. Pero, en principio, la idea es la misma, interrumpir un elemento regulador en lugar del propio gen utilizando un enfoque de pérdida de función.
G. Korkmaz et al., Pantallas genéticas funcionales para elementos potenciadores en el genoma humano mediante CRISPR-Cas9, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt .3450, 2016.
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