Hacia las pruebas de COVID-19 en cualquier momento y en cualquier lugar

ARRIBA: Una maqueta de la prueba en el hogar actualmente en desarrollo por Mammoth Biosciences y GlaxoSmithKlineMAMMOTH BIOSCIENCES

A fines de enero, cuando el COVID-19 La pandemia estaba cobrando fuerza, Charles Chiu, investigador de la Universidad de California en San Francisco, se acercó a sus colegas de la empresa de biotecnología Mammoth Biosciences, con sede en San Francisco. El grupo Chius y el equipo de Mammoth ya habían colaborado en el desarrollo de una prueba de diagnóstico basada en CRISPR para la enfermedad de Lyme, que pensaron que se traduciría fácilmente en la detección del SARS-CoV-2, dice.

El sistema CRISPR permite Chiu, quien forma parte del consejo asesor científico de Mammoths, le dice a The Scientist. En dos o tres semanas, pudimos pasar de solo diseñar el ensayo a lograr que realmente funcione. trabajar y demostrar que podemos usarlo para identificar rápidamente o potencialmente diagnosticar el SARS-CoV-2 a partir de muestras clínicas.

El estándar de oro para detectar un virus como el SARS-CoV-2 es la PCR de transcripción inversa, que requiere el aislamiento del ARN de una muestra seguido de la conversión del ARN en ADN y la posterior PCR para amplificar cualquier ácido nucleico viral. Si bien es sensible, este tipo de prueba requiere la recolección de una muestra, como saliva o un hisopo nasal, y el transporte de esa muestra a un laboratorio clínico para su procesamiento. A principios de año, había escasez de reactivos para este tipo de prueba.

El nuevo ensayo desarrollado por Chiu y sus colegas se llama SARS-CoV-2 DETECTR (para SARS-CoV-2 DNA endonuclease-targeted reportero trans CRISPR); los investigadores publicaron detalles sobre cómo funciona en Nature Biotechnology el 16 de abril. La prueba es rápida: después de la extracción del ARN, se tarda menos de una hora en obtener un resultado. Y utiliza la amplificación mediada por bucle (LAMP), que tiene lugar a una sola temperatura, en lugar de las temperaturas de ciclo necesarias para la PCR, lo que significa que no se requiere un termociclador costoso.

La enzima más utilizada para CRISPR la modificación genética es Cas9, que, guiada por una secuencia corta de ARN, encuentra y escinde un ácido nucleico diana. DETECTR utiliza una enzima diferente, Cas12, que también sigue un ARN guía hasta su objetivo (en este caso, las secuencias del SARS-CoV-2), pero escinde algo más que su objetivo; también comienza a cortar los ácidos nucleicos cercanos. El ensayo incluye una molécula indicadora que, cuando Cas12 la escinde durante el frenesí de corte precipitado por el reconocimiento del ácido nucleico del SARS-CoV-2, se puede visualizar en una tira reactiva, similar a una prueba de embarazo casera.  

En su artículo, los autores informaron que la sensibilidad de DETECTR era comparable a un ensayo de PCR de transcripción inversa realizado en un laboratorio clínico en aproximadamente 80 muestras de pacientes. El 9 de julio, el ensayo recibió la autorización de uso de emergencia (EUA) de la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA), solo para su uso en el laboratorio clínico de la Universidad de California en San Francisco. Desde entonces, los desarrolladores han seguido centrándose en hacer que la prueba sea más accesible y fácil de usar.

En la iteración que se aprobó para EUA, todavía hay un paso de extracción de ARN, explica Chiu. Ese es un problema posible porque hubo una escasez de reactivos de extracción hace solo uno o dos meses, y también está limitado por el hecho de que las extracciones generalmente demoran entre media hora y una hora, por lo que. . . terminamos modificando esta prueba para que podamos ejecutar la reacción LAMP directamente desde [una] muestra original.

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El 20 de mayo, Mammoth Biosciences se asoció con la compañía farmacéutica GlaxoSmithKline Consumer Healthcare para desarrollar aún más DETECTR en un dispositivo portátil desechable que sería apropiado para uso doméstico y sería tan costoso como una prueba de embarazo casera.

La forma en que funcionarán los diagnósticos en el lugar de necesidad y en el hogar es si realmente son todo en uno, dice Trevor Martin, director ejecutivo de Mammoth Biosciencess. Debe ser tan fácil de usar como una prueba de embarazo, y también creíamos firmemente que debe brindarle resultados tan confiables y precisos como los que obtendría en el laboratorio.

Amplificar sin PCR

Desde que la pandemia de COVID-19 comenzó a despegar en los EE. UU. en marzo, las pruebas se han centrado en gran medida en personas que ya tienen síntomas, en parte porque los recursos son limitados. El problema es que parece que el virus es más contagioso en el momento en que aparecen los síntomas, lo que significa que si las personas están esperando para ponerse en cuarentena o tomar otras medidas de protección hasta obtener un resultado positivo, es posible que ya hayan infectado a otros.</p

Las pruebas en la etapa más temprana de los síntomas son útiles desde una perspectiva epidemiológica para comprender cómo el COVID afecta a los pacientes, dice Rahul Dhanda, director ejecutivo de Sherlock Biosciences, una biotecnología con sede en Cambridge, Massachusetts, que desarrolla diagnósticos y ahora se enfoca en el SARS-CoV -2. Pero en términos de prevención y seguimiento del historial de enfermedades, lo que desea hacer es evaluar a las personas asintomáticas.

Con el objetivo de detectar más casos antes de que se propaguen y evitar problemas en la cadena de suministro, una serie de los laboratorios académicos y de biotecnología están ideando nuevas estrategias y explotando la tecnología existente para hacer que las pruebas sean más simples y estén disponibles en entornos distintos a los consultorios médicos y laboratorios clínicos.

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En un estudio publicado en PLOS Pathogens el 27 de agosto, por ejemplo, un grupo con sede en China describió una prueba que se basa en la extracción de ARN que llaman CRISPR-COVID. Su ensayo aprovecha Cas13a, una enzima que se comporta de manera similar a Cas12 para escindir un indicador monocatenario que emite fluorescencia cuando el ARN del SARS-CoV-2 está presente, y otro tipo de amplificación isotérmica (temperatura constante), la amplificación de polimerasa de recombinasa de transcripción inversa. En el estudio, los autores estiman el costo de una prueba CRISPR-COVID en alrededor de $ 3,50, pero predicen que podría ser tan bajo como $ 0,70 si los reactivos se compraran a granel. La versión actual es la más adecuada para el laboratorio, ya que requiere un paso de extracción de ARN y un equipo especializado para detectar señales fluorescentes.

El hecho de que pueda realizar una prueba de diagnóstico molecular en la palma de la mano tus manos es algo que nunca antes había sido posible.

Rahul Dhanda, director ejecutivo de Sherlock Biosciences

En un estudio publicado el 31 de agosto en PNAS,&nbsp Los investigadores desarrollaron una prueba que usa LAMP directamente en muestras de pacientes y detecta el SARS-CoV-2 con un cartucho de microfluidos y un lector portátil basado en un teléfono inteligente. Debido a que no requiere extracción de ARN o amplificación por PCR, este enfoque podría permitir la implementación escalable de diagnósticos de COVID-19 sin infraestructura y recursos de laboratorio, especialmente en entornos donde se requiere diagnóstico en el punto de recolección, como escuelas, instalaciones que cuidado de ancianos o discapacitados, o eventos deportivos, escriben los autores.

La pandemia actual no es la primera vez que se desarrolla LAMP para diagnosticar infecciones virales. Debido a su portabilidad, se ha implementado en brotes de ébola y zika. Pero la tecnología no está exenta de inconvenientes. Hay un par de problemas con la amplificación isotérmica, advierte Max Wilson, biólogo de la Universidad de California, Santa Bárbara (UCSB). Wilson ha desarrollado una prueba COVID-19 en uso en UCSB que usa CRISPR para detección y PCR para amplificación. En nuestras manos. . . [LAMP] es menos sensible que otros métodos de amplificación, explica.

Otro problema es que si todo el mundo comienza a usar LAMP, los reactivos, que no se fabrican en volúmenes compatibles con las pruebas a escala pandémica, podrían volverse más difíciles de obtener, dice Wilson. La producción no ha sido simplificada ni optimizada.

A pesar de estos y otros problemas, existen muchos marcos de prueba complementarios y realmente prometedores, agrega. Todos los diversos enfoques, las pruebas en el hogar, las pruebas de laboratorio de muestras tomadas en centros de atención médica y los ensayos que podrían usarse para evaluar a miles de personas diariamente, como en los departamentos de salud pública o en las grandes universidades, ni siquiera compiten por los recursos o la capacidad de fabricación. , dice Wilson, y todos son necesarios.

Hay una gran cantidad de necesidades insatisfechas en lo que respecta a las pruebas de COVID-19, está de acuerdo Martin. Solo necesitamos todas las manos a la obra.

Aprovechando la biología sintética