Inyectar a las cucarachas con el gen CRISPR modifica su descendencia

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Los huevos duros y protectores de algunos insectos, como la cucaracha Blatella germanica, hace que sea imposible realizar la edición de genes CRISPR convencional, ya que los componentes deben inyectarse en el embrión. Sin embargo, un equipo internacional de investigadores ha desarrollado un método para editar genes de insectos mediante la inyección de ribonucleoproteínas Cas9 y guía de ARN directamente en el líquido hemolinfático circulante similar a la sangre de la madre en lugar del embrión. Con esta técnica, denominada CRISPR parental directo (o DIPA-CRISPR), los investigadores pudieron, por primera vez, editar genes en cucarachas, como se informó en un estudio publicado por primera vez en línea el 16 de mayo en Cell Reports Methods.

La inyección de componentes CRISPR en insectos adultos para editar su descendencia se ha logrado antes en mosquitos Aedes aegypti , pero el método desarrollado anteriormente, llamado transducción de ovario mediada por receptor of Cargo (ReMOT), fusiona la proteína Cas9 con un ligando específico de especie, lo que mejora la eficiencia de las ediciones al aumentar la absorción de Cas9 y los ARN de guía única en el óvulo en desarrollo. DIPA-CRISPR elimina el ligando específico de la especie, lo que hace que el procedimiento sea más fácilmente generalizable a otras especies, dicen los investigadores a The Scientist.

Este emocionante resultado abre plantean la posibilidad de utilizar esta tecnología en muchas otras especies de insectos que son difíciles de inyectar en la etapa embrionaria.

Omar Akbari, Universidad de California, San Diego

Lo que muestran aquí es, en este sistema, realmente no necesita el ligando de orientación. Simplemente inyectan una gran cantidad de [Cas9] en la hemolinfa durante el proceso de desarrollo del óvulo. Cuando los ovarios absorben una gran cantidad de material del sistema circulatorio de los insectos, el complejo de ribonucleoproteína Cas9 parece estar siendo absorbido pasivamente, dice Jason Rasgon, epidemiólogo de enfermedades de la Universidad Estatal de Pensilvania que desarrolló ReMOT pero que no participó en el estudio actual. . 

Rasgon también destaca un estudio anterior que demostró la edición exitosa de genes en arañas rojas (Tetranychus urticae) mediante inyección en adultos. Sin embargo, agrega que el estudio actual es la primera vez, que yo sepa, que ha demostrado ser eficiente. En los ácaros araña, los investigadores solo lograron una eficiencia de aproximadamente la mitad de un por ciento con CRISPR-Cas9, lo que significa que la edición de genes deseada se integró con éxito en el sitio de destino una de cada 200 veces. La nueva técnica logró una eficiencia de hasta el 21,8 % en las cucarachas y más del 70 % en el escarabajo rojo de la harina Tribolium castaneum.

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La serendipia jugó un papel en el desarrollo de DIPA-CRISPR, dice Xavier Belles, experto en metamorfosis de insectos en el Instituto de Biología Evolutiva de Barcelona, quien es coautor del nuevo estudio. Cuando los investigadores estaban realizando pruebas sistemáticas de varios fragmentos de péptidos para que sirvieran como ligandos para las cucarachas, incluyeron un grupo de control negativo que no recibió ningún ligando. Inesperadamente, el control estaba más activo que los demás, le dice Belles a The Scientist. Así que decidimos trabajar solo con Cas9 y la guía de ARN, y estos funcionan maravillosamente.

Con DIPA-CRISPR, los investigadores inyectan una enzima Cas9 disponible comercialmente y guían el ARN en el hemocele, la cavidad corporal principal del madre cucaracha. Esta inyección debe programarse en el momento justo para que coincida con la producción de huevos, cuando se incorporan grandes cantidades de proteínas de la yema a los huevos, encontraron los investigadores. [L]os componentes del CRISPR que inyectamos en el cuerpo van acompañando a las proteínas y entran también en los ovocitos, para luego afectar al embrión que se desarrollará más tarde tras la cópula y la fecundación, dice Belles.

Los investigadores también realizaron experimentos complementarios agregando pequeños fragmentos de ADN al genoma de la cucaracha. Que yo sepa, esta es la primera vez que se muestra con un procedimiento de inyección para adultos, dice Rasgon. Si bien solo se agregaron tramos cortos de ADN, las inserciones fueron lo suficientemente largas como para insertar pequeñas secuencias funcionales.

Este emocionante resultado abre la posibilidad de utilizar esta tecnología en muchas otras especies de insectos que son difíciles de inyectar al principio. etapa embrionaria, Omar Akbari, biólogo celular y del desarrollo de la Universidad de California en San Diego, que no participó en el estudio, le dice a The Scientist en un correo electrónico.

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Takaaki Daimon, genetista de la Universidad de Kyoto en Japón y coautor del nuevo estudio, le dice a The Scientist en un correo electrónico que los investigadores quería desarrollar un método de edición del genoma que cualquiera pudiera usar y que fuera muy fácil y económico. De hecho, como señala Rasgon, los investigadores que buscan editar genomas con DIPA-CRISPR pueden usar Cas9 disponible comercialmente y ya no tienen que configurar sistemas de expresión de proteínas para producir un ligando específico de especie, como con ReMOT. La inyección para adultos también funciona sin microinyectores que, de otro modo, serían necesarios para introducir los componentes CRISPR en los diminutos huevos de varias especies. Rasgon dice que le diría a los investigadores que quieran adaptar el método ReMOT a su especie que primero lo prueben de esta manera [con DIPA-CRISPR], y si eso funciona, genial. Y si no, ven a hablar con nosotros. Agrega que DIPA-CRISPR no funcionará para todas las especies, ya que probó la inyección directa sin ligandos en garrapatas y moscas blancas sin éxito.

Daimon espera que la inyección directa en adultos se pueda realizar en la mayoría de los insectos. pero enumera varias limitaciones. Las inyecciones deben aplicarse a las hembras adultas en un momento específico, cuando se están formando las yemas, y este período debe identificarse con anticipación para cada especie objetivo, agrega. Algunas especies no tienen esta etapa; DIPA-CRISPR no les es aplicable. Como resultado, DIPA-CRISPR no es adecuado para el modelo Drosophila melanogaster o algunos dípteros superiores, como la mosca de los establos Stomoxy calcitrans, escriben los autores en el artículo. Sin embargo, Belles espera usar el nuevo método en la cucaracha no modelo, para la cual la interferencia de ARN, un método que usa ARN de doble cadena específico de secuencia para silenciar la expresión génica pero no edita el genoma, ha sido hasta ahora la única forma. para reducir y sondear la función de los genes, diciéndole a The Scientist que Esto abre la posibilidad de estudiar la función de los genes sobre los que aún no tenemos información.