Las mutaciones del coronavirus podrían confundir las pruebas PCR de COVID-19

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Los cambios en el genoma del SARS-CoV-2, incluidos algunos de los que se encuentran en las variantes que circulan actualmente, pueden afectar negativamente la detección del virus mediante PCR de transcripción inversa (RT), según un estudio publicado el 26 de abril en el Journal of Clinical Microbiology. Los investigadores proponen que las mutaciones en los loci reconocidos por los cebadores de ADN pueden reducir la amplificación de las secuencias virales y, como resultado, dificultar potencialmente la detección del virus en muestras de individuos positivos para COVID-19.

Este hallazgo no es motivo de pánico en toda regla, dicen los autores. Pensamos que tal vez esto podría ser más común que no. Pero resulta que, en realidad, es bastante raro, dice el coautor David Wang, virólogo de la Universidad de Washington. Wang y sus colegas recomiendan que las pruebas de diagnóstico incluyan más de un objetivo para garantizar una detección adecuada del SARS-CoV-2. Si bien una serie de productos ya incluyen varios objetivos genéticos, algunos ensayos de RT-PCR de COVID-19 autorizados para uso de emergencia marcan solo uno.

Los cebadores utilizados para los ensayos de RT-PCR se desarrollaron a principios de la pandemia, cuando el virus SARS-CoV-2 fue secuenciado por primera vez. Con base en información sobre otros coronavirus, los investigadores diseñaron cebadores de PCR para amplificar secuencias en el genoma viral que se cree que permanecen relativamente estables. El enfoque se ha utilizado con gran éxito, detectando SARS-CoV-2 en muestras de hisopos nasofaríngeos, saliva e incluso aguas residuales.

En la Universidad de Washington, el laboratorio de diagnóstico molecular del Hospital Barnes-Jewish ha estado utilizando la prueba Roche cobas SARS-CoV-2 para procesar muestras de pacientes. Busca el gen viral ORF1ab así como el gen E, que codifica la proteína de la cubierta. Para cualquier muestra dada, estos objetivos deberían tomar aproximadamente la misma cantidad de ciclos de PCR para ser detectados, un valor conocido como el umbral del ciclo.

Si tiene un valor alto en un gen, tiene un valor alto en el otro gen y viceversa, dice el coautor Bijal Parikh, patólogo clínico de la Universidad de Washington y director médico del laboratorio de diagnóstico molecular. Si bien la mayoría de las muestras que su equipo procesó tenían valores de umbral de ciclo similares para los dos objetivos, algunas se desviaron de la correlación esperada: a veces, el gen E no se amplificó en el mismo grado que ORF1ab.

A pesar de este curioso resultado, las pruebas aún identificaron correctamente las muestras positivas para SARS-CoV-2 en función de la señal ORF1ab. Para averiguar qué estaba pasando con el gen E, el equipo secuenció un puñado de muestras virales. Descubrieron que tres muestras tenían una mutación común en el gen E, una que no estaba presente en ninguna de las variantes comunes que ahora circulan en la población. Los investigadores proponen que la mutación afecta la unión del cebador de PCR e interfiere con la amplificación.

Desafortunadamente, no pudieron confirmar esta hipótesis porque las secuencias del cebador y la sonda de los ensayos no están disponibles públicamente. Sin embargo, el sitio mutado se encuentra dentro de la secuencia objetivo de los cebadores utilizados en un ensayo del gen E ampliamente utilizado desarrollado por investigadores de Charit Universittsmedizin Berlin en Alemania.

Otro estudio publicado en septiembre en el Journal of Clinical Microbiology informó resultados similares, donde las mutaciones en un sitio diferente dentro de la secuencia del gen E, objetivo del conjunto de sonda de cebador Charit, también interfirieron con RT-PCR en Roche cobas Ensayo SARS-CoV-2. Y en diciembre de 2020, Emily Crawford, bioquímica de la Universidad de California, San Francisco, y sus colegas informaron en el Journal of Clinical Microbiology un hallazgo relacionado: mutaciones en el gen N del SARS-CoV-2, que codifica la proteína de la nucleocápside del virus, redujo la sensibilidad de la prueba de RT-PCR al interferir con la unión del cebador.

Todavía estamos aprendiendo cuáles son las regiones más conservadas del virus y cuáles son las menos conservadas, dice Crawford. Hasta que realmente determinemos eso, tenemos que estar alerta, para estar preparados para que aparezca una mutación en cualquier lugar.

La comunidad científica necesita más de este tipo de estudios, dice Chantal Vogels, viróloga. en la Escuela de Salud Pública de Yale, que no participó en el nuevo trabajo. Dirigió un estudio publicado en julio de 2020 en Nature Microbiology que analizó la sensibilidad y la eficiencia de los conjuntos de cebadores de SARS-CoV-2. Los investigadores descubrieron que una discrepancia entre un cebador y su secuencia objetivo resultó en una disminución de la sensibilidad de la prueba.

Ensayos de PCR para capturar un virus en evolución

La Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) ha reconoció que las mutaciones del SARS-CoV-2 podrían interferir con las pruebas de COVID-19 y continúa monitoreando las variantes y evaluando los efectos potenciales en los ensayos de diagnóstico. La agencia también ha brindado recomendaciones a los desarrolladores para diseñar pruebas de modo que las mutaciones virales tengan una evasión mínima, por ejemplo, al incluir múltiples objetivos genéticos. La FDA también aconseja a los desarrolladores que estén atentos a las mutaciones que podrían alterar el rendimiento de la prueba y transmitir claramente las limitaciones de la prueba.

Desde el principio, hemos estado muy atentos a todas las diferentes variantes, dice Palani Kumaresan, el jefe de investigación y desarrollo de Roche Diagnostic Solutions. En este momento, la compañía no planea cambiar su prueba. La señal del gen E es pan-sarbecovirus, el subgénero de virus que incluye tanto el SARS-CoV como el SARS-CoV-2. Una señal específica del SARS-CoV-2 proviene de Orf1ab. Cuando combinamos esos dos, no vemos ningún impacto, dice Kumaresan. Aún así, Roche está monitoreando las variantes de coronavirus para detectar cualquier reducción en el rendimiento y ha lanzado una prueba de variante SARS-CoV-2 por separado con fines de investigación.

Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de EE. UU. monitorean regularmente los cebadores. y sondas para su panel de diagnóstico de COVID-19 y prueba multiplex para la gripe y el COVID-19, le dice un representante de los medios de comunicación de los CDC a The Scientist por correo electrónico. Los CDC también rastrean y caracterizan activamente las variantes del coronavirus a través de los esfuerzos de vigilancia genómica.

Mientras el virus siga cambiando, lo cual es algo natural, solo necesita seguir monitoreando, dice Vogels. Tener estos estudios disponibles que analizan eso solo mejora nuestras pruebas.

S. Tahan et al., La variante del gen E del SARS-CoV-2 altera las características de sensibilidad analítica de la detección viral mediante un ensayo comercial de RT-PCR, J Clin Microbiol, doi:10.1128/JCM.00075-21, 2021.