Los científicos clonan el genoma del SARS-CoV-2 con un método basado en levadura rápida

Levadura que contiene el SARS-CoV-2Andrew Hemphill, Beatrice Frey, Universidad de Berna

Los investigadores han generado un clon completo del nuevo genoma del coronavirus utilizando cromosomas en la levadura de cerveza, según un artículo publicado en Nature el lunes (4 de mayo). Mientras que otros laboratorios están construyendo, o han construido, clones de SARS-CoV-2 por métodos alternativos, un beneficio importante del sistema de levadura es su velocidad y estabilidad, dicen los investigadores.

Lo emocionante de la levadura es eso . . . es rápido, dice la microbióloga y experta en coronavirus Susan Weiss de la Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania, que no era miembro del equipo de investigación. Los otros métodos son tediosos y difíciles.

Reconstruir y modificar los genomas de los virus que causan enfermedades es el punto de partida de muchos esfuerzos de investigación en virología. Estas manipulaciones genéticas son esenciales para estudiar el método de infección de un virus, su replicación, los medicamentos que podrían funcionar contra él y las posibles vacunas.

Durante los brotes y pandemias de nuevos virus, la velocidad es esencial para la clonación, dice el virólogo Darwyn Kobasa de la Universidad de Manitoba, quien no participó en la investigación, especialmente si surgen nuevas variantes. Agrega que la velocidad de esta nueva técnica es realmente impresionante.

La idea es aprender sobre el virus y sus debilidades, dice el coautor Volker Thiel de la Universidad de Berna. Al igual que los científicos de todo el mundo que realizan este tipo de estudios, Thiel y su equipo trabajan en una instalación de alta contención con estrictos protocolos de bioseguridad y seguridad diseñados para proteger a los investigadores y evitar la liberación accidental de cualquier virus.

Posiblemente lo más El método ampliamente utilizado para clonar genomas virales consiste en unir fragmentos de ADN e introducirlos en la bacteria Escherichia coli para su replicación. Pero para algunos virus, incluidos los coronavirus, el enfoque puede ser problemático. En primer lugar, [los coronavirus] tienen genomas extraordinariamente grandes, dice Thiel, lo que dificulta que las bacterias los enfrenten, y también, partes del genoma son inestables o pueden ser tóxicas para las bacterias por razones que no están del todo claras.

Debido a que las células de levadura son más grandes que las bacterias, pueden manejar fragmentos de ADN más grandes. Y hay otra gran ventaja, dice el coautor Joerg Jores, también de la Universidad de Berna. Las células de levadura tienen una capacidad inherente para ensamblar fragmentos de ADN en una molécula grande.

Lo que esto significa es que, en lugar de tener que reconstruir primero el ADN viral antes de introducirlo en las células, en su lugar se colocan todos estos fragmentos en la levadura y los une mágicamente, dice Weiss.

Este ensamblaje automático de fragmentos está en el corazón del método de clonación descrito anteriormente utilizado por el equipo llamado recombinación asociada a la transformación (TAR). Para reconstruir el SARS-CoV-2, Thiel, Jores y sus colegas generaron 14 fragmentos de ADN que representan el genoma completo del virus (algunos amplificados a partir del ARN viral, otros sintetizados). Cada fragmento compartía una región corta de secuencia superpuesta con el siguiente para que la célula de levadura pudiera identificar qué extremos coincidían. Los dos fragmentos finales del genoma también compartían secuencias superpuestas con un vector plásmido que contendría el genoma viral y le permitiría formar un cromosoma artificial de levadura (YAC). El proceso de pegado se denomina recombinación homóloga e implica recortar los nucleótidos al final de una hebra de ADN y unir las secuencias complementarias restantes (la sección superpuesta) a otro fragmento.

La capacidad de recombinar cosas en un YAC por sí mismos es simplemente increíble, dice Jores.

Su equipo introdujo los fragmentos en células de Saccharomyces cerevisiae y recogió y analizó colonias para detectar la presencia del genoma completo dos días después. La transcripción in vitro del ADN extraído de dichos clones produjo ARN, que utilizaron para infectar células de mamíferos cultivadas. Desde la introducción del ADN en la levadura hasta la recuperación del virus de ARN infeccioso tomó solo una semana. El equipo también ha clonado una versión del SARS-CoV-2 que codifica un indicador fluorescente para análisis de drogas de alto rendimiento, dicen.

Un artículo reciente en Cell Host & Microbe informó sobre la construcción de un genoma completo de SARS-CoV-2 a través de un proceso llamado ligadura in vitro. Este método también es bastante rápido, dice Thiel, pero aún tiene el problema de usar E. coli para clonar los fragmentos individuales antes de la ligadura. Además, con el sistema de levadura, dice, tenemos un [YAC] clonado de forma estable que siempre podemos reutilizar, por lo que no tenemos que volver a ensamblar mediante ligación in vitro cada vez que se necesitan partículas de virus infecciosos.

Como además de acelerar el proceso de clonación, la técnica resuelve algunos de los problemas inherentes a la clonación en E. coli, dice Kobasa, como la inestabilidad o la toxicidad de determinados fragmentos de ADN.

Efectivamente, el investigador del coronavirus Luis Enjuanes del Centro Nacional de Biotecnología de Madrid que actualmente está clonando el SARS-CoV-2 usando el sistema bacteriano, dice que un fragmento del genoma está causando un poco de toxicidad. Confía en que su equipo puede resolver el problema y agrega que, si bien está impresionado por la velocidad de la tecnología de la levadura, una ventaja del sistema bacteriano es que cualquiera puede hacerlo. Manipulaciones genéticas en E. coli es estándar en la mayoría de los laboratorios de biología molecular de todo el mundo, mientras que el uso de levadura de esta manera es menos frecuente.

Los autores utilizaron la técnica TAR para clonar una variedad de otros virus, incluidos MERS y Zika , pero dicen que el enfoque de su trabajo en este momento es, como es lógico, el SARS-CoV-2. Estamos trabajando 24 horas al día, 7 días a la semana, dice Thiel. Estamos intentando salvar el mundo, añade Jores entre risas.

TTN Thao et al., Reconstrucción rápida del SARS-CoV-2 usando una plataforma de genómica sintética, Naturaleza, doi:10.1038/s41586-020-2294-9, 2020.

X. Xie et al., An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2, Cell Host & Microbio, doi:10.1016/j.chom.2020.04.004, 2020.