Manteniendo CRISPR bajo control
Estructura de la proteína Cas9 de Staphylococcus aureus WIKICOMMONS, THOMAS SPLETTSTOESSER Un equipo de científicos que previamente identificó genes dentro de genomas de bacteriófagos que codifican proteínas anti-CRISPR ahora ha descubierto fagos que albergan un antídoto para la enzima Cas9 ese es un componente clave del sistema CRISPR predominante que se usa hoy como una herramienta de edición de genes. El equipo, dirigido por Alan Davidson de la Universidad de Toronto, describió tres genes anti-Cas9 codificados por bacteriófagos y demostró que las proteínas correspondientes pueden bloquear la actividad de CRISPR-Cas9, derivada de sistemas bacterianos CRISPR-Cas tipo II. ;en células humanas. en un papel El trabajo del equipo, publicado la semana pasada (8 de diciembre) en Cell, podría ayudar a los investigadores a comprender mejor los sistemas CRISPR naturales y modular mejor la actividad de las herramientas de edición de genes basadas en CRISPR para investigación y aplicaciones clínicas. .
En particular, el trabajo «se dirige específicamente a Cas9 y luego aplica los descubrimientos en células humanas». Harvard’s George Church…
La identificación de las tan esperadas proteínas anti-CRISPR para sistemas de tipo II comenzó con búsquedas in silico clásicas basadas en la similitud de secuencia con proteínas anti-CRISPR ya conocidas, Philippe Horvath, un científico sénior de DuPont en Francia que demostró por primera vez que el sistema CRISPR proporciona resistencia a los fagos en procariotas y que tampoco participó en el estudio, escribió en un correo electrónico a The Scientist. Lo que es menos trivial en este trabajo, y realmente astuto, es la combinación iterativa de búsquedas de similitud de secuencias y análisis de contexto genético, que profetiza que los análogos anti-CRISPR de tipo II deberían encontrarse en ubicaciones equivalentes en secuencias completamente no relacionadas.
Vea que hay CRISPR en su yogur
Desde 2013, Davidson y sus colegas encontraron originalmente cinco genes que codificaban proteínas de fagos que bloqueaban la actividad del sistema CRISPR tipo IF. Luego siguieron con la identificación de nueve proteínas de fago más que inhibían los sistemas CRISPR de tipo IF e IE, todos ubicados dentro de los genomas de Proteobacteria.
Ver antídotos de CRISPR en abundancia
Para el presente estudio , los investigadores ampliaron su búsqueda para identificar secuencias dentro de especies bacterianas, buscando proteínas anti-CRISPR adicionales codificadas dentro de genomas bacterianos. El equipo volvió a buscar secuencias con homología con aca1 y aca2, dos genes que codifican supuestos reguladores transcripcionales que se encontraron previamente junto a genes anti-CRISPR.
Los investigadores encontraron una supuesta proteína anti-CRISPR codificada dentro del genoma de Brackiella oedipodis, que alberga un sistema CRISPR de tipo II-C que incluye Cas9. Debido a que se sabe que Neisseria meningitidesresponsable de algunos tipos humanos de meningitistiene un sistema CRISPR-Cas de tipo II, Davidson y sus colegas demostraron que los genes anti-CRISPR en un plásmido , cuando se transforma en N. meningitidis, podría bloquear el sistema CRISPR-Cas de las células tipo II. Luego identificaron un homólogo de la B. oedipodis anti-CRISPR, así como dos anti-CRISPR adicionales dentro de la N. meningitidis genoma.
Las proteínas anti-CRISPR purificadas de N. meningitidis interactuó con Cas9 purificado de la misma especie in vitro, encontró el equipo. Mezclar Cas9, ADN diana y ARN de guía única y la actividad de corte de ADN precisa de Cas9 necesaria con una de las proteínas anti-CRISPR evitó los cortes de ADN de doble cadena.
La proteína anti-CRISPR también funcionó en células humanas. Cuando el equipo transfectó células humanas en cultivo con plásmidos que codifican Cas9, un ARN guía dirigido a genes y la proteína anti-CRISPR, la proteína recién descubierta pudo bloquear la edición del genoma de Cas9. Usando células humanas cultivadas que expresan una forma desactivada de Cas9 que se une al ADN pero no puede crear una ruptura de doble cadena, los investigadores descubrieron que la proteína anti-CRISPR evita que Cas9 se una a su sitio genómico especificado en el ARN.
Las tres proteínas [anti-CRISPR] se unen a Cas9 de diferentes maneras para bloquear la actividad de división del ADN de las enzimas, dijo Davidson. Su laboratorio ahora está trabajando para comprender cómo estas proteínas interactúan con Cas9 para prevenir su actividad. Esperamos que haya muchos más anti-CRISPR frente a otros sistemas CRISPR, dijo.
El interés evidente de las proteínas anti-CRISPR que inhiben los sistemas de tipo II es la posibilidad de modular la actividad de Cas9 en aplicaciones de edición de genes, escribió Horvath. La expresión de estas proteínas inhibidoras podría desencadenarse en respuesta a una condición dada, o en un momento particular en el desarrollo de un organismo, lo que detendría la actividad de Cas9. Una forma inteligente de guardar el bisturí molecular en su estuche de seguridad.
Una aplicación potencial especialmente intrigante de los anti-CRISPR, según Church, son los impulsores genéticos que se están desarrollando para controlar los mosquitos y otros vectores de enfermedades.
Por ahora, el presente estudio mejora la comprensión de los científicos sobre la inmunidad implicada en la interacción entre las bacterias y sus virus. De todos nuestros estudios [sobre estas proteínas anti-CRISPR], concluimos que existe una gran ventaja evolutiva para que los fagos tengan estos anti-CRISPR, dijo Davidson.
Conocimiento sobre cómo funcionan las proteínas anti-CRISPR también es relevante para otras aplicaciones de los sistemas CRISPR-Cas. Saber cómo el enemigo viral evade la inmunidad basada en CRISPR proporcionará información valiosa sobre las formas de combatir mejor [los virus], escribió Horvath.
A. Pawluk et al., Apagados naturales para CRISPR-Cas9, Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.11.017, 2016.
Interesado en leer más?
El científico ARCHIVOS
Conviértase en miembro de
Reciba acceso completo a más de 35 años de archivos, así como TS Digest, ediciones digitales de The Scientist, artículos destacados ¡y mucho más!Únase gratis hoy ¿Ya es miembro?Inicie sesión aquí