Pantalla CRISPR detecta regulación genética funcional

© BRYAN SATALINOLa mayor parte del ADN no codifica proteínas. Y descubrir cómo, cuándo y dónde esta «materia oscura» genómica; juega un papel en la regulación de genes es una empresa enorme. Ahora, los científicos han desarrollado una herramienta que podría ayudar. En un artículo publicado hoy (3 de abril) en Nature Biotechnology, un equipo de la Universidad de Duke en Durham, Carolina del Norte, describe una técnica de detección de alto rendimiento que utiliza CRISPR-Cas9 edición del epigenoma para identificar elementos reguladores en los genomas de las células humanas.

“Resulta que la mayor parte de la variación genética que es responsable de enfermedades complejas más comunes, como enfermedades cardiovasculares, diabetes y trastornos neurológicos&mdash ;realmente ocurre en esta región entre genes” dijo el coautor Charles Gersbach de Duke. «Lo emocionante es tener métodos disponibles para anotar la función del genoma no codificante». agregó.

“El genoma no codificante es enorme, y puede ser un desafío identificar qué regiones son importantes para modular…

Gersbach y sus colegas crearon bibliotecas lentivirales de ARN guía para apuntar a elementos reguladores probables en varias megabases de ADN que rodean dos loci de interés: -globina y HER2. Luego generaron líneas celulares con una proteína fluorescente integrada para informar sobre la activación del gen diana.

Los autores transdujeron sus líneas celulares con una de las dos versiones de la proteína Cas9 con actividad de nucleasa desactivada, denominada dCas9. La forma represora de dCas9 recluta proteínas que metilan la lisina 9 en la histona H3, lo que conduce a la formación de heterocromatina y la represión génica en las secuencias diana. La forma activadora de dCas9 se une a los potenciadores o promotores de ADN específicos y facilita la acetilación de la lisina 27 en la histona H3, lo que da como resultado la activación del gen.

A continuación, los investigadores transdujeron sus líneas celulares con las bibliotecas de ARN guía. en niveles bajos para asegurar que un único ARN guía estaría presente en cada célula. A continuación, clasificaron las células en función de la fluorescencia y secuenciaron el ARN guía presente en células con una expresión génica diana especialmente alta y baja.

La identificación de secuencias confirmó los elementos reguladores conocidos y reveló nuevas funciones para otras secuencias de ADN. Muchas, aunque no todas, de estas secuencias aparecían tanto en las pantallas de activación como de represión. Y algunas secuencias parecían desempeñar un papel regulador para un gen en un tipo de célula, pero no para el mismo gen en otro tipo de célula. Aunque los cambios observados en la expresión génica fueron sutiles, los autores validaron el papel regulador de las secuencias de ADN individuales.

Sabemos que hay varios aspectos del epigenoma que se correlacionan muy fuertemente con los cambios en la regulación génica, y su Siempre ha sido una lucha convertir esas observaciones en una comprensión real de cómo se regulan realmente los genes, dijo el coautor Tim Reddy de Duke a The Scientist

Todavía no sabemos si la epigenética particular modificación que observamos es la causal, dijo Reddy. Pero ahora sabemos por esto, y por otros trabajos de nuestros laboratorios y otros, que la modificación del epigenoma sí tiene un papel en la regulación de algunos de estos genes diana.

Richard Sherwood del Brigham and Womens Hospital en Boston, que no participó en el estudio, dijo que esta técnica de detección podría ayudar a los investigadores a interpretar las grandes cantidades de datos genómicos que se han generado como parte de proyectos como ENCODE. Es emocionante: cuantas más herramientas tenemos en la caja de herramientas, más preguntas diferentes podemos abordar, dijo Sherwood.

Reddy, Gersbach y sus colegas están trabajando para ampliar la técnica de detección, a fin de examinar elementos reguladores candidatos en todo el genoma a través de diferentes tipos de células y tejidos. También planean aprovechar la técnica en un esfuerzo por comprender mejor ciertas enfermedades.

Hay tantos lugares donde sabemos que la regulación genética contribuye a la enfermedad, dijo Reddy. Ahora podemos comenzar a obtener nuevos conocimientos realmente claros sobre los mecanismos que causan esas enfermedades, y esos mecanismos en sí mismos podrían ser una vía para la terapia. Esos mecanismos podrían ayudar a guiar mejores diagnósticos, podrían ayudar a diferenciar a los pacientes que responden o no a la terapia, [y] eso puede informar mejores tratamientos para los pacientes.

TS Klann et al., CRISPR- La edición del epigenoma Cas9 permite la detección de alto rendimiento de elementos reguladores funcionales en el genoma humano, Nature Biotechnol., doi:10.1038/nbt.3853, 2017.

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