Preguntas planteadas sobre el modelo de barrera hematoencefálica ampliamente utilizado

ARRIBA: ISTOCK.COM, UNOL

Un conocido modelo in vitro de la barrera hematoencefálica que se utiliza ampliamente en estudios de enfermedades neurodegenerativas y en investigación preclínica se realiza a partir del tipo incorrecto de células, según afirma un artículo de PNAS  este mes (4 de febrero).

Los investigadores informan en el estudio que las células producidas utilizando un protocolo de laboratorio popular, que implica la reprogramación de células madre pluripotentes humanas (hPSC), muestran patrones de expresión génica típicos de las células epiteliales que recubren los órganos humanos, en lugar de los del cerebro sanguíneo. Se supone que imitan las células endoteliales de barrera (BBB).

Los autores del artículo, que ha alimentado el debate en la comunidad de investigación de BBB desde que se publicó por primera vez como preimpresión en bioRxiv en 2019, dicen que los hallazgos plantean serias dudas sobre el valor del modelo en los estudios de neurociencia y drogas en curso. Otros investigadores, incluidos los diseñadores del protocolo, le dicen a The Scientist que los documentos son una contribución útil al campo, aunque defienden el papel de los protocolos en el avance de la investigación de BBB a lo largo de los años.

David Begley, que dirige un grupo de BBB en el Kings College de Londres y no participó en el artículo ni en el diseño del protocolo, dice que cree que el estudio PNAS contiene una gran cantidad de buenos datos y destaca la necesidad de que los investigadores evaluar las limitaciones de sus modelos. Creo que hacer un modelo in vitro absolutamente perfecto de la barrera hematoencefálica in vivo va a ser muy, muy difícil, si no imposible, dice Begley, que no usa el protocolo en su propio trabajo. Lo que es de vital importancia es comprender los modelos in vitro, lo que harán y lo que no harán.

El endotelio BHE actúa como una pared semipermeable entre los vasos sanguíneos del cerebro y el sistema nervioso central. Los medicamentos administrados sistémicamente para tratar trastornos cerebrales deben atravesar esta pared para tener el efecto deseado, lo que hace que los modelos BBB sean una parte fundamental de muchos programas de desarrollo de medicamentos.

El protocolo en cuestión fue descrito por primera vez por la Universidad de Wisconsin ( Los investigadores de UW)Madison Ethan Lippmann, Samira Azarin, Sean Palecek, Eric Shusta y sus colegas en Nature Biotechnology en 2012. El método consiste en tratar las hPSC in vitro para alentarlas a diferenciarse en células que exhiban muchas de las propiedades de la BBB, incluida la resistencia eléctrica y la impermeabilidad a varias moléculas.

Estas células reprogramadas, que Lippmann y sus colegas denominaron células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de hPSC (BMEC, por sus siglas en inglés), podrían fabricarse rápidamente y en grandes cantidades, y ofreció una alternativa a los modelos animales y los enfoques in vitro más engorrosos que se usaban en ese momento. Desde entonces, el protocolo y sus numerosos derivados han sido ampliamente adoptados por científicos académicos y de la industria.

Si su objetivo es apuntar al cerebro, necesita la expresión de esos transportadores. No están ahí.

Raphal Lis, Weill Cornell Medicine

Raphal Lis, investigador de células madre en Weill Cornell Medicine y coautor del artículo PNAS, dice que él le dio al investigador asociado Tyler Lu la tarea de trabajar con el protocolo cuando Lu se unió al laboratorio hace varios años, pensando que podrían comenzar a trabajar en modelos BBB. En las células resultantes, dice Lis, el equipo se sorprendió al descubrir que las células carecían de muchas de las características típicas del endotelio, mientras que poseían otras propiedades que generalmente se observan en el epitelio, un tipo de capa celular que se asienta alrededor de los órganos internos y forma la capa más externa de la piel. . 

En los análisis descritos en el artículo del equipo, Lu, Lis y el colega de Weill Cornell, David Redmond, determinaron que las células derivadas de hPSC no expresaban varios genes clave asociados con el endotelio, algunos de los cuales codifican el transporte de membrana proteínas que pueden ser críticas para determinar qué mol Las eculas pueden pasar a través de la BBB. Estas células fueron completamente mal identificadas en investigaciones anteriores, dice Lis. Si tu objetivo es apuntar al cerebro. . . necesitas la expresión de esos transportadores. No están allí.

Lu señala que experimentos posteriores indicaron que las células derivadas de hPSC no reaccionan de la forma en que las células endoteliales deberían reaccionar ante ciertos estímulos, como las moléculas de señalización inflamatorias, un hallazgo con repercusiones para la investigación de enfermedades basadas en estos modelos Para ponerlo en términos sencillos, dice Lu, es como si estuviéramos probando medicamentos destinados al cerebro en la piel o en el intestino.

El documento incluye algunos pasos diseñados para mejorar el protocolo, específicamente, mediante la adición de factores de transcripción para hacer que las células se parezcan más al endotelio. Estos pasos tienen el efecto no deseado de interrumpir algunas otras propiedades de BBB, como la resistencia eléctrica, pero Lis dice que cree que es una mejora sustancial en las células epiteliales que se usan actualmente. Es la primera etapa de una corrección, dice, y agrega que el equipo ahora está trabajando para mejorar su propia versión del modelo. Prefiero tener una célula endotelial para probar cosas que una capa epitelial.

Los hallazgos del equipo fueron replicados por Dritan Agalliu de la Escuela de Medicina Irving de la Universidad de Columbia y sus colegas, quienes también son autores en el PNAS papel. Lis dice que desde entonces varias empresas de biotecnología se han puesto en contacto con su grupo sobre el trabajo, aunque se negó a nombrarlas.

Los investigadores de Weill Cornell Medicine informan que las células creadas con un protocolo de laboratorio popular formaron estructuras de tipo epitelial en lugar de endoteliales. (arriba, marcador de células epiteliales EPCAM en púrpura). La sobreexpresión de ciertos factores de transcripción llevó a las células a un estado más parecido al endotelial (abajo, marcadores de células endoteliales VE-Cad y PECAM1 en rojo y verde, respectivamente). CORTESÍA DE LIS LAB

Limitaciones reconocidas del protocolo UW

Hablando con The Scientist, los UWs Palecek y Shusta, quienes poseen varias patentes sobre el protocolo, dicen que los equipos de Weill Cornell El análisis exhaustivo de las células derivadas de hPSC es útil, pero cuestiona algunas de las afirmaciones hechas por los autores. Por un lado, nosotros y otros nunca afirmamos que fueran auténticas, completamente idénticas a las células endoteliales in vivo, dice Palecek. Existen múltiples modelos de la barrera hematoencefálica, y ninguno de ellos es una réplica exacta de la barrera hematoencefálica in vivo.

Shusta agrega que el trabajo de los equipos de la UW se ha replicado en muchos otros laboratorios que muestran que las células producen marcadores de proteínas endoteliales y que exhiben propiedades BBB consideradas importantes en la investigación de enfermedades y la administración de fármacos. Con Palecek y otros, también publicó recientemente un protocolo modificado para crear células para su uso en la investigación de las interacciones de las BBB con el sistema inmunitario.

Shusta destaca un comentario del pasado mes de octubre en el que fue coautor con Palecek, Lippmann, y Azarin, en el que el equipo aborda la preimpresión bioRxiv de los equipos de Lis, así como un par de otros estudios recientes que muestran cierta expresión génica similar al epitelio en las células derivadas de hPSC. El comentario propone a partir de ahora llamar a las células células hPSC-derivadas de BMEC-like (énfasis suyo). 

Existen múltiples modelos de la barrera hematoencefálica por ahí, y ninguno de ellos es una réplica exacta de la barrera hematoencefálica in vivo.

Sean Palecek, Universidad de Wisconsin-Madison

En cuanto a las posibles implicaciones de los hallazgos para la investigación de la industria, dice Shusta Creo que es peligroso sugerir que una empresa farmacéutica o biotecnológica utilice un modelo exclusivamente para el desarrollo y diseño de fármacos. . . . Es uno de una batería de pruebas. (Biogen, una de las empresas que ha utilizado la tecnología, rechazó una solicitud de comentarios).

Peter Searson, de la Universidad Johns Hopkins, que ha trabajado con el protocolo pero no está involucrado en el trabajo de ninguno de los equipos, dice que su vale la pena recordar que el protocolo representó una gran mejora con respecto a otros enfoques disponibles hace una década, cuando los modelos de BBB más utilizados contenían células MDCK (riñón canino de Madin-Darby), que son células epiteliales de un perro.

Hacia mejores modelos in vitro

Searson dice que, si bien está de acuerdo con el objetivo de caracterizar la expresión génica en estos modelos, cree que el equipo de Weill Cornell ha omitido un contexto importante en su artículo. En lugar de ser una demostración de que el protocolo de Lippmann no es útil, dice, el artículo es parte del proceso científico en curso.

Los investigadores que hablaron con The Scientist dicen que el debate, parte de ella calentada, ha estado ocurriendo durante varios años. Lis dice que al principio de su proyecto, él y sus colegas se ofrecieron a colaborar con el grupo Shustas para evaluar el protocolo, pero su oferta fue rechazada. Shusta dice que su equipo también intentó, sin éxito, colaborar con los investigadores de Weill Cornell.

Lis, Lu y Redmond le dicen a The Scientist que piensan que las evaluaciones adecuadas de la El protocolo se ha visto obstaculizado por la renuencia de los investigadores de BBB a desafiar métodos bien establecidos y por los millones de dólares que se han invertido en el trabajo basado en el protocolo a lo largo de los años. Mucha gente . . . después de que se publicaron los primeros dos artículos importantes, dejaron de examinar demasiado las características de estas células, dice Lu.

Anna Herland, que trabaja en modelos neuronales in vitro en el KTH Royal Institute of Technology y el Instituto Karolinska en Suecia y que colaboró con el equipo de Shustas hace unos años, dice que existe cierto dogma en el campo cuando se trata de metodología. Los investigadores a menudo luchan para justificar el desarrollo de modelos BBB nuevos y mejorados para los financiadores y las instituciones, algo que ella dice que espera que pueda cambiar después del estudio de los equipos de Weill Cornell y la discusión subsiguiente sobre las limitaciones de los modelos.

Necesitamos mejorar nuestra modelos in vitro, dice Herland. En su opinión, el desarrollado por Lippmann y sus colegas sigue siendo uno de los mejores modelos, agrega, pero el artículo de PNAS es un recordatorio importante de que los investigadores deben caracterizar y comprender completamente con qué están trabajando. Los científicos que reprograman células madre deberían preguntarse qué obtenemos y para qué lo usamos. ella dice. Me gusta que cada vez se mencione más esta discusión.

TM Lu et al., El epitelio derivado de células madre pluripotentes mal identificado como endotelio microvascular cerebral requiere factores ETS para adquirir el destino vascular, PNAS, 118:e2016950118, 2021.