Próxima generación: GFP dinámico a nanoescala
Fibras de queratina visualizadas usando rsEGFP. Barra de escala, 10 micrómetros. Grotjohann et al., eLifeEl dispositivo: ajustando unos pocos residuos de proteínas, los investigadores del Instituto Max Planck de Química Biofísica en Alemania han creado un nuevo tipo de proteína GFP mejorada (EGFP) que permite una resolución extremadamente alta de estructuras dinámicas en células vivas sin dañar los niveles de potencia del láser.
La nueva sonda fluorescente, rsEGFP2, se basa en una versión anterior de EGFP capaz de cambiar reversiblemente entre los estados fluorescente y oscuro, rsEGFP. Los investigadores, dirigidos por los autores principales Stefan Hell y Stefan Jakobs de Max Planck, mutaron solo unos pocos aminoácidos para producir un EGFP que cambia más rápidamente que las iteraciones anteriores. En un estudio publicado el pasado diciembre en eLife, demostraron que el nuevo fluoróforo también dura más, resistiendo la «fotofatiga»; que desgasta las proteínas fluorescentes y las deja atrapadas en un estado después de demasiadas rondas de…
Las imágenes dinámicas de células vivas son extremadamente importantes para comprender sus procesos, explicó Joerg Bewersdorf, biofísico de la Universidad de Yale que no participó en la investigación. Pero muchas estructuras pequeñas, como los orgánulos, son muy difíciles de resolver usando microscopía estándar porque son significativamente más pequeñas que la longitud de onda de la luz visible, lo que hace imposible enfocar una imagen usando técnicas estándar. Una estrategia para aumentar el poder de resolución de un microscopio, desarrollada por Hell, se llama agotamiento de emisión estimulada (STED). En STED, un láser excita las sondas fluorescentes mientras que un láser diferente, enfocado en un anillo alrededor de la primera, apaga las otras sondas, lo que resulta en la fluorescencia de solo unos pocos fluoróforos alrededor del área de interés, trayendo esa parte de la imagen a foco.
Pero STED requiere láseres extremadamente brillantes para funcionar, lo que puede ser muy dañino para las células vivas. Cambiar a fluoróforos reversibles que pueden cambiar lentamente entre estados permite usar láseres más tenues, una técnica conocida como RESOLFT (transiciones de fluorescencia óptica saturable reversible). Mediante el uso de fluoróforos reversibles de larga duración, no tenemos que apresurarnos a colocar fotones, explicó Hell, por lo que la técnica necesita menos luz.
Novedades: la tecnología RESOLFT formó el base del rsEGFP original, pero la proteína cambia entre estados de encendido y apagado muy lentamente, anotó Bewersdorf. Tomando alrededor de una hora para tomar una imagen, fue tan lento que no había forma de usarlo realmente en una configuración general de celda viva donde las cosas se mueven, dijo.
En el desarrollo de rsEFGP2, Hell y su sus colegas optimizaron la estrategia RESOLFT para permitir a los investigadores tomar imágenes hasta 260 veces más rápido, capturando la naturaleza dinámica de una célula viva y haciendo que la noción de usar RESOLFT para crear videos sea una posibilidad futura, dijo Bewersdorf.
La importancia: La capacidad de excitar fluoróforos a niveles de energía más bajos y cambiar rápidamente entre estados de encendido/apagado debería permitir obtener imágenes de resolución extremadamente alta de procesos dinámicos en células vivas sin preocuparse por daños.
La nueva GFP es una gran ventaja, explicó Dominique Bourgeois, biólogo estructural del Centro Nacional de Investigación Científica Frances que no participó en el desarrollo de proteínas. Permite que la microscopía vaya más rápido y obtenga imágenes más dinámicas de lo que sucede en las células vivas, al tiempo que reduce la cantidad de luz fototóxica a la que están expuestas, agregó Bourgeois.
La nueva tecnología posiblemente podría usarse en una amplia variedad de aplicaciones, dijo Bewersdorf. Los orgánulos subcelulares como las mitocondrias, que son difíciles de capturar por microscopía porque, a 250 nanómetros, son más pequeños que la longitud de onda de la luz, ahora se pueden visualizar en células vivas, en lugar de las células fijas necesarias para la microscopía electrónica, predijo. Además, la velocidad de generación de imágenes más rápida podría hacer que los videos de súper alta resolución sean una posibilidad.
Bourgeois prevé que la nueva tecnología se aplique para generar imágenes de interacciones dinámicas minúsculas, como virus que ingresan a las células huésped. Jakobs y Hell dicen que los láseres tenues de RESOLFT también les permitirán visualizar interacciones cambiantes in vivo, como la dinámica de las neuronas en desarrollo.
Necesita mejorar: Actualmente, la información obtenida de RESOLFT solo asciende a un solo píxel. Jakobs y Hell tienen planes para crear matrices de láser que permitan obtener imágenes de áreas más grandes a la vez, sin embargo, regiones de hasta 100 micras cuadradas.
T. Grotjohann et al., rsEGFP2 permite una nanoscopía RESOLFT rápida de células vivas, eLife, doi:10.7554/eLife.00248, 2012.
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