Qué aportan los pseudovirus al estudio del SARS-CoV-2
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Cuando el SARS-CoV-2 comenzó a propagarse por todo el mundo, no todos los laboratorios equipado para estudiarlo directamente. El virus detrás de la pandemia actual es altamente patógeno y transmisible, lo que lleva a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. a exigir muchas de las mismas pautas de bioseguridad que dan forma al estudio de enfermedades como la tuberculosis y el ébola.
Como en En muchos momentos a lo largo del último año, la comunidad científica respondió adaptando de forma creativa las herramientas existentes para el estudio de la COVID-19. Entre estos, los investigadores recurrieron a modelos del patógeno, como los pseudovirus y los virus quiméricos, que pueden estudiarse de forma segura en laboratorios con una autorización de nivel de bioseguridad (BSL) más baja que la requerida para estudiar la versión de tipo salvaje, en un esfuerzo por ampliar el estudio del nuevo coronavirus. . Los pseudovirus no se replican, lo que los vuelve inofensivos, pero al reemplazar las proteínas de su envoltura superficial con las del SARS-CoV-2, los investigadores pueden obtener información sobre las formas en que el patógeno infecta las células. Un virus quimérico se crea insertando el material genético de un virus en el genoma de otro sustituto seguro, y estas secuencias introducidas se transmiten cuando el virus se replica.
Además de su seguridad, los pseudovirus son extremadamente versátiles en el sentido de que puede . . . introduce diferentes proteínas de la cubierta y puedes introducir mutaciones, lo que hace que sea extremadamente útil para nosotros detectar muchas variantes diferentes, dice Carol Weiss, viróloga que dirige el laboratorio de inmunorregulación en la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. Si desea introducir mutaciones en virus reales, es mucho más trabajo.
Una aproximación de lo real
Los pseudovirus se desarrollaron por primera vez en la década de 1960, después de que los científicos comenzaran a estudiar un virus de la estomatitis vesicular (VSV) aislado de ganado bovino. Además de replicarse bien en cultivo, más tarde supieron que su proteína de superficie, VSV-G, facilita la entrada en todas las células eucariotas, lo que convierte al virus en un vector útil no solo como pseudovirus sino también como transbordador para llevar ADN a las células con fines terapéuticos. . La primera vacuna contra el ébola se desarrolló utilizando una plataforma VSV y, más recientemente, el virus se diseñó para buscar y destruir células cancerosas.
Las plataformas basadas en el VIH, que surgieron en la década de 1980, han desde que reemplazó a VSV como el modelo más común para desarrollar virus pseudo y quiméricos. A diferencia del genoma de ARN de cadena negativa del VSV que debe transcribirse una vez dentro de la célula, el genoma de ARN de cadena positiva del VIH puede comenzar a traducirse instantáneamente, lo que hace que los pseudovirus basados en el VIH sean más rápidos de producir. Los virus modelo basados en el VIH ahora se han utilizado en muchas de las mismas aplicaciones que el VSV, y los científicos los aplican al estudio de enfermedades como el SIDA, el SARS, el MERS y la influenza.
Queríamos para validar realmente que la herramienta que generamos apareció exactamente, con todo lo que pudimos aportar, de la misma manera que el SARS-CoV-2.
Sean Whelan, Universidad de Washington
Para aprovechar estos sustitutos para estudiar el SARS-CoV-2, los investigadores primero necesitaban demostrar que sus virus pseudo y quiméricos son sustitutos viables del verdadero. El SARS-CoV-2 es un virus excepcionalmente voluminoso, su genoma tiene aproximadamente 30 kilobases, mientras que el VIH y el VSV tienen alrededor de 10 kilobases y, aunque es más similar al VIH, ninguno de los tres está estrechamente relacionado. Afortunadamente, tanto el VIH como el VSV parecen ser compatibles para hacer modelos de coronavirus.
Sean Whelan, virólogo de la Universidad de Washington en St. Louis, es uno de los muchos científicos que ha desarrollado una plataforma viable de virus quiméricos y cuantificado su desempeño frente a anticuerpos contra lo real. Para hacer esto, desarrolló dos ensayos complementarios, uno para usar en laboratorios de enfermedades infecciosas con la autorización BSL-3 requerida para manejar SARS-CoV-2 vivo y otro para laboratorios que trabajan con una autorización BSL-2 más baja y estudió cómo cada virus respondió a un batería de diferentes tratamientos. No fue suficiente, dice, para probar la capacidad del virus para evadir un solo tipo de anticuerpo, por lo que utilizó anticuerpos monoclonales y policlonales y suero de pacientes recuperados de COVID-19, así como un tipo de proteína señuelo ACE2 sugerida como una posible terapia para extraer el virus lejos del propio receptor de las células. Realmente queríamos validar que la herramienta que generamos apareciera exactamente, con todo lo que pudiéramos ofrecerle, de la misma manera que el SARS-CoV-2.
Consulte una guía para el SARS-CoV emergente -2 variantes
El ensayo BSL-2 diseñado por Whelan utiliza un VSV quimérico que incluye la proteína de punta del SARS-CoV-2 y produce una proteína verde fluorescente como señal de infección (también se usa a menudo la luciferasa). Whelan expuso células humanas a su virus quimérico hasta que se infectaron 100 células. Luego, bañó las células en cada tipo de anticuerpo y la proteína señuelo y registró qué tan rápido y en qué medida el virus quimérico pudo escapar de ellas.
Simultáneamente, el colega de Whelans, Mike Diamond, inmunólogo en Washington University School of Medicine, desarrolló un ensayo BSL-3 utilizando un aislado clínico vivo de SARS-CoV-2. De manera similar al ensayo de Whelans, expuso 100 células infectadas a la misma letanía de pruebas y usó inmunotinción para rastrear las células infectadas a lo largo del tiempo.
Los resultados, publicados en Cell Host and Microbe en septiembre, demostraron que los dos ensayos producen perfiles de neutralización para cada exposición que se alinean el 93 % del tiempo, lo que significa que el virus quimérico es un indicador adecuado para evaluar la capacidad de los anticuerpos para desactivar SARS-CoV-2. Muchos artículos han publicado resultados similares, comparando sus ensayos con el coronavirus de tipo salvaje. Esta validación contra el virus real es importante, dice Whelan, porque un virus quimérico se parece a COVID por fuera, pero no es COVID por dentro.
Un medio rápido para rastrear variantes emergentes
Si bien los estudios que involucran aislamientos verdaderos de SARS-CoV-2 siempre serán el estándar de oro para comprender la dinámica compleja de COVID-19, hay casos en los que los virus pseudo y quiméricos son mejores opciones. Por un lado, tales modelos son inherentemente más estables genéticamente que sus contrapartes de tipo salvaje. Los virus cambian un poco cada vez que interactúan con un nuevo host y las copias individuales dentro de una sola persona pueden no ser idénticas. En el laboratorio, los virus también pueden desarrollar nuevas mutaciones en respuesta a los tipos de células utilizadas para cultivarlos. Los virus que se propagan en células de mono, por ejemplo, pueden adoptar mutaciones diferentes a las que se cultivan en células humanas.
Una de las principales ventajas es la facilidad de uso en el laboratorio.
Carol Weiss, Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU.
Cuando los científicos diseñan proxies del SARS-CoV-2, pueden controlar parte de esa variación mediante el uso de plásmidos que contienen un solo clon de la proteína espiga. Una de las principales ventajas es la facilidad de uso en el laboratorio, dice Weiss de la FDA a The Scientist. No es una mezcla de mutaciones. Sabemos exactamente lo que estamos probando.
En algunos casos, los investigadores quieren estudiar específicamente nuevas mutaciones para, por ejemplo, ver cómo podrían cambiar la eficacia de las vacunas. Ya han surgido variantes notables en el Reino Unido, Sudáfrica y Brasil que reducen la eficacia de algunas vacunas. Sudáfrica detuvo recientemente el lanzamiento de la vacuna AstraZenecas después de que solo produjo una respuesta débil contra la enfermedad leve y moderada, y Moderna anunció planes para modificar la segunda iteración de su vacuna en un esfuerzo por mantenerse firme contra estas nuevas variantes. Para estudiar tales mutaciones en la proteína espiga, los pseudovirus ofrecen un modelo mucho más rápido para generar y probar nuevas versiones que el virus real. Al tener que clonar cada nueva variante a medida que surge en especímenes de tipo salvaje para evaluar si los anticuerpos de los individuos vacunados serán efectivos, los pseudovirus permiten a los científicos crear rápidamente nuevos modelos con las mismas mutaciones para realizar sus experimentos. Theodora Hatziioannou, viróloga de la Universidad Rockefeller, dice que ella examina rutinariamente hasta 1,000 muestras de pseudovirus en 48 horas para determinar si alguna es motivo de preocupación, un proceso que tomaría mucho más tiempo si esperara aislamientos clínicos vivos de SARS. -CoV-2 con las mismas mutaciones. Con los pseudovirus, puede analizar muchas más muestras mucho más rápido con las réplicas apropiadas. montó una robusta respuesta de anticuerpos al virus. Extrajeron y aislaron 18 anticuerpos únicos asociados con el dominio de unión al receptor (RBD) de proteínas de pico y expusieron un virus quimérico basado en VSV que porta el pico de SARS-CoV-2 a cada tipo de anticuerpo individualmente para ver qué mutaciones se seleccionan como virus. se replica.
Luego, diseñaron pseudovirus basados en el VIH con cada mutación de pico única que resultó de los experimentos de VSV y usaron su propio ensayo de neutralización para determinar si las mutaciones conferían resistencia a los anticuerpos contra el SARS-CoV-2. . Para confirmar que el virus se comportaría igual cuando se expusiera a un cóctel de muchos anticuerpos diferentes, como en un cuerpo humano, los investigadores también compararon los pseudovirus con el plasma extraído de pacientes recuperados.
Sus resultados, compartida en el servidor de preimpresión bioRxiv el 19 de enero y recientemente aceptada en Nature, demuestra que muchas mutaciones disminuyen la capacidad de los anticuerpos neutralizantes para combatir el virus de manera efectiva. En todos los casos, las mutaciones identificadas por el VSV [virus quimérico] fueron mutaciones que confirieron resistencia en el seudotipo del VIH, dice Hatziioannou, aunque agrega que las vacunas siguen siendo una herramienta importante. Cuando observaron específicamente las mutaciones encontradas en las variantes B.1.351 y B.1.1.7, identificadas por primera vez en Sudáfrica y el Reino Unido, respectivamente, encontraron que la capacidad de neutralización era un poco más débil que un virus sin estas sustituciones, pero el los efectos fueron en general pequeños.
Donde los virus pseudo y quiméricos se quedan cortos
Si bien estas plataformas sustitutas han sido herramientas útiles para estudiar cómo el SARS-CoV-2 ingresa a nuestras células, siempre habrá ser una necesidad de laboratorios BSL-3 que puedan estudiar el virus directamente. La desventaja de usar pseudotipos es que la única propiedad biológica que realmente vas a aprender sobre los coronavirus son aquellas propiedades que se relacionan con la proteína espiga, le dice a The Scientist Vicente Planelles, patólogo de la Universidad de Utah. . Tan pronto como vayamos más allá de los procesos de los que es responsable el pico, necesitamos un modelo diferente.
Ninguna plataforma de pseudovirus puede recapitular completamente cómo el virus se propaga y libera nuevas copias de sí mismo, por ejemplo, ni puede los científicos los usan para estudiar otros mecanismos por los cuales el virus elude el sistema inmunológico del cuerpo.
Además, mientras que los pseudovirus son útiles para evaluar la eficacia de las vacunas y las terapias con anticuerpos, son menos útiles con respecto a evaluando otros medicamentos que tratan la gravedad de la enfermedad. Remdesivir, por ejemplo, se destacó como una opción prometedora al principio de la pandemia antes de que la evidencia contradictoria pusiera en duda su efectividad. Pero la familia de medicamentos a la que pertenece remdesivir, llamados análogos de nucleósidos, podría resultar útil para prevenir enfermedades extremas si los científicos pudieran encontrar un mejor candidato. Estos medicamentos funcionan al interferir con la capacidad de replicación de un virus, lo que los pseudovirus no hacen. Si encontramos análogos de nucleósidos que funcionen mejor que remdesivir, estaríamos en excelente forma, dice Planelles. Pero no se puede probar eso con un pseudovirus, porque el gen [al que se dirige el fármaco] es un gen interno que no es el pico.