Una prueba autónoma de COVID-19 con piezas impresas en 3D

ARRIBA: El dispositivo miSHERLOCK brilla intensamente si una muestra de saliva contiene ARN del SARS-CoV-2. INSTITUTO WYSS DE LA UNIVERSIDAD DE HARVARD

Desde el comienzo de la pandemia de COVID-19, los investigadores se han esforzado por desarrollar pruebas de bajo costo para detectar la presencia de SARS-CoV-2 en muestras de pacientes. Ahora, un equipo de investigadores con sede en el Instituto Wyss de la Universidad de Harvard y el MIT han presentado una plataforma de prueba rápida y económica capaz de distinguir entre las principales variantes del SARS-CoV-2, según un artículo publicado el viernes (6 de agosto) en Science Advances .  

La plataforma, llamada miSHERLOCK (pronunciado my-sherlock), es completamente autónoma desde la preparación de la muestra hasta la lectura de la prueba. No requiere equipos o instrumentos externos, y finalmente está destinado a ser construido por el usuario a partir de piezas imprimibles en 3D y componentes electrónicos alimentados por batería. El equipo estuvo dirigido por el ingeniero biomédico James Collins, quien también es cofundador y director de Sherlock Biosciences, una empresa creada en torno a la herramienta de diagnóstico basada en CRISPR llamada SHERLOCK que emplea la plataforma (de ahí miSHERLOCK: la abreviatura de SHERLOCK mínimamente instrumentado).  

Este dispositivo no es la primera prueba basada en SHERLOCK para detectar el SARS-CoV-2. En mayo pasado, la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. otorgó una autorización de uso de emergencia a una plataforma diferente que emplea la misma tecnología CRISPR para la prueba de COVID-19, y otro ensayo SHERLOCK desarrollado recientemente puede brindar un resultado positivo de COVID similar a una prueba de embarazo.

Sin embargo, esas pruebas aún requieren pasos externos y equipo de laboratorio para el procesamiento de muestras, mientras que una prueba miSHERLOCK se ejecuta de principio a fin dentro del dispositivo autónomo. La preparación de muestras sin procesar para el análisis de ácidos nucleicos requiere varios pasos, incluida la apertura de células y partículas virales para acceder a los ácidos nucleicos, la extracción de proteínas y otros componentes celulares de la muestra que podrían interferir con la reacción, todo mientras se tiene cuidado de no degradar los ácidos nucleicos; El ARN monocatenario es particularmente sensible a la degradación.

El trabajo descrito en este documento es realmente innovador, porque combina la [plataforma] sin instrumentos con la detección CRISPR, dice el ingeniero biomédico Changchun de la Universidad de Connecticut Liu, que no participó en el estudio.

Ver: «Hacia las pruebas de COVID-19 en cualquier momento y en cualquier lugar»

La especialista en enfermedades infecciosas del Boston Childrens Hospital y coautora del estudio, Rose Lee, dice que la La motivación del proyecto miSHERLOCK fue crear una plataforma de pruebas que funcionara en entornos con recursos limitados, incluidas clínicas con acceso limitado a equipos de laboratorio y técnicos de laboratorio capacitados, o incluso dentro de la propia casa. Ella dice que al principio de la pandemia, los materiales de prueba convencionales, como hisopos nasales y medios de transporte de muestras, escaseaban. Lee recuerda que el equipo preguntó: ¿Podríamos crear un diagnóstico más simple que permitiera realizar pruebas descentralizadas, especialmente a medida que comienzan a aparecer las variantes?

El resultado fue un ensayo que solo requería unos pocos pasos del usuario y ningún equipo más allá. lo que se incluye en el aparato de prueba, que cabe en la palma de una mano. La prueba requiere dos mililitros (menos de media cucharadita) de saliva. Después de que el usuario escupe en el tubo y agrega algunas sustancias químicas, la saliva desciende por una columna en la primera cámara de reacción impresa en 3D, que se calienta a 95 C mediante el calentador a batería. Las partículas virales se rompen y los ácidos nucleicos de la muestra, como el genoma de ARN del virus SARS-CoV-2, se concentran en una membrana especial en la parte inferior de la columna. Luego, el usuario transfiere la columna a la segunda cámara impresa en 3D (que funciona a 37 C) y empuja un émbolo, colocando la membrana en un tubo nuevo y liberando agua para activar la reacción SHERLOCK de un solo recipiente liofilizado.

El procedimiento de diagnóstico requiere que un usuario escupa en la cámara de preparación de muestras y luego transfiera el disco de recolección a la cámara de reacción y presione un émbolo, lo que activa la reacción y minimiza el riesgo de contaminación cruzada. Instituto Wyss de la Universidad de Harvard

SHERLOCK, que significa desbloqueo de reportero enzimático específico de alta sensibilidad, implica un par de pasos. Primero, cualquier ARN en la muestra se convierte en ADN. Luego, un paso de amplificación hace copias de una región específica de un gen viral. La amplificación utiliza una enzima en lugar de los ciclos de temperatura tradicionales de PCR para abrir la plantilla de ADN objetivo, lo que significa que toda la reacción se desarrolla a una temperatura constante. Finalmente, una enzima Cas12a unida a un ARN guía específico del SARS-CoV-2 escanea el ADN en la mezcla de reacción en busca de la secuencia viral que lo complementa. Si lo encuentra, el ARN guía se unirá a él y Cas12a se activará y comenzará a cortar indiscriminadamente los ácidos nucleicos que lo rodean, incluida una sonda indicadora que emite una fluorescencia brillante si se corta.

Al final de la reacción en un dispositivo miSHERLOCK, las luces LED dentro de la cámara de reacción brillan en la muestra, haciendo que las pruebas positivas brillen intensamente. En el caso de la fluorescencia tenue, los investigadores han desarrollado una aplicación complementaria para teléfonos inteligentes que ayuda a los usuarios a determinar si tienen una prueba positiva y también les permite informar instantáneamente su resultado a los funcionarios locales de salud pública. Según el documento, todo el proceso dura aproximadamente una hora, tiene un límite de detección comparable al de las pruebas de PCR aprobadas actualmente y el aparato completo solo cuesta alrededor de $ 15.

Creo que este es uno de los solo ejemplos en los que puede pasar de literalmente ningún equipo como nada más allá de lo que está en el dispositivo en sí mismo para generar un resultado en el lapso de una hora, dice el gastroenterólogo del Hospital General de Massachusetts y coautor del estudio Xiao Tan.

Escupir sucede

Los autores dicen que la idea detrás de usar saliva en lugar de hisopos nasofaríngeos más invasivos (y a menudo temidos) era simple, y Liu agrega que la recolección de saliva no invasiva es ideal para el diagnóstico en el punto de atención. Es más conveniente que las muestras de hisopos, dice.

Pero tan fácil como escupir en un tubo, extraer ácidos nucleicos de la saliva es una historia diferente. La saliva es una mezcla compleja, dice Tan, llena de enzimas que básicamente matarán cualquier reacción o causarán un exceso de falsos positivos porque, al igual que la enzima CRISPR en la prueba, las nucleasas salivales pueden atravesar la sonda indicadora de los ensayos.

Consulte: «Diagnóstico de COVID-19: ¿Cómo se comparan las pruebas de saliva con los hisopos?»

Para neutralizar las proteínas y enzimas que podrían interferir con el ensayo, la columna de muestra ofrece un doble golpe: un tres- una incubación de un minuto a 95 C más los productos químicos agregados por el usuario inactivan las enzimas y dejan intacto el ARN viral. En su forma actual, los investigadores tuvieron que agregar los químicos manualmente, pero prevén una versión comercial del producto precargado con químicos liofilizados que recubren el interior del tubo y se rehidratan cuando el usuario agrega su saliva. p>

Además de poder probar la infección general por SARS-CoV-2, la especificidad de Cas12a significa que puede usarse para distinguir entre variantes del patógeno. Al cambiar el ARN guía Cas12as de detectar una secuencia genérica de SARS-CoV-2 a una que detecta mutaciones específicas de variantes, pudieron determinar correctamente qué variante habían agregado a las muestras de saliva más del 95 por ciento de las veces, aunque el límite de detección fue diferente de una variante a otra. Los investigadores diseñaron otra versión de la plataforma de prueba en la que cuatro cámaras de reacción pueden funcionar una al lado de la otra, cada una de las cuales utiliza diferentes ARN guía específicos de variante. Aunque admiten que miSHERLOCK no puede reemplazar la secuenciación tradicional para descubrir nuevas variantes, dicen que esperan que ayude a rastrear la propagación de variantes en todo el mundo, especialmente en áreas que no tienen fácil acceso a equipos de secuenciación.

La especificidad es lo que es realmente emocionante, dice la estudiante de posgrado del MIT y coautora Devora Najjar. Cuando hacemos la detección de variantes, estamos detectando entre SNP dentro de la proteína espiga, y eso es súper, súper, súper alta resolución en términos de lo que estás buscando a nivel de ácido nucleico. Agrega que es raro tener una prueba que sea a la vez tan rápida y específica hasta el nivel de un solo par de bases.

Aún no está listo para el horario de máxima audiencia

El Los investigadores dicen que su objetivo es hacer que toda la plataforma de prueba sea lo suficientemente barata y fácil para que cualquier persona pueda ensamblarla de principio a fin y eliminar pasos que normalmente requieren equipos como pipetas o termocicladores, pero miSHERLOCK no está listo para implementarse en pacientes confinados en el hogar. o médicos remotos todavía. Lee dice que la iteración actual del prototipo estaba destinada a la publicación académica, no al uso en el hogar, y agrega que, si bien los planos imprimibles en 3D para las cámaras de reacción están disponibles gratuitamente, el prototipo actual aún requiere bastante montaje</p

Creo que sería realmente increíble si una persona pudiera imprimir en 3D esta prueba en su propia casa, obtener algunos componentes, ensamblarlos ellos mismos como si fueran muebles de IKEA y luego simplemente comprar los [componentes] que pueden usar, dice Helena de Puig, postdoctorado en Wyss y coautor. Alternativamente, dice, los usuarios podrían comprar las piezas impresas en 3D y ensamblarlas, o incluso comprar el dispositivo completamente ensamblado. En cualquier caso, los usuarios tendrían que comprar kits que contengan los componentes de la reacción de SHERLOCK liofilizados y partes de la prueba que solo se pueden usar una vez, como la membrana de captura de ARN o el émbolo. Tan dice que prevén que los componentes de la reacción de SHERLOCK, que incluyen el Cas12a específico del patógeno, sean tan fáciles de cambiar como los diferentes sabores de las bolsitas de café instantáneo.

Los cuatro primeros autores del artículo de miSHERLOCK, en la foto de derecha a izquierda: Devora Najjar, Rose A. Lee, Helena de Puig y Xiao TanWYSS INSTITUTE AT HARVARD UNIVERSITY

Además del hardware que debe ajustarse para la fabricación comercial, el ensayo en sí deberá someterse a pruebas y aprobación completas por parte de la FDA antes de que pueda ser lanzado al público en general. Una limitación importante del estudio actual es que miSHERLOCK solo se probó en 27 muestras clínicas, señala Jonathan Parr, médico de enfermedades infecciosas y epidemiólogo molecular de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, en un correo electrónico a The Scientist. Parr desarrolla diagnósticos basados en CRISPR para la malaria, pero no participó en el estudio actual. Los donantes de muestra fueron todos pacientes de COVID-19 de República Dominicana y ninguno estaba infectado con variantes preocupantes, agrega. Si bien los autores reconocen la escasez de muestras clínicas en su artículo, Parr dice que, no obstante, plantea preocupaciones sobre el rendimiento real de su ensayo.

En el artículo, los investigadores explicaron que había pocas muestras disponibles para analizar porque Las muestras de saliva no se han recolectado de forma rutinaria para las pruebas de SARS-CoV-2. Tuvieron que arreglárselas con lo que tenían, razón por la cual sus pruebas de especificidad se realizaron en muestras de saliva disponibles en el mercado (pero no infectadas) que estaban enriquecidas con diferentes variantes, y no incluyeron pruebas en la variante Delta ahora dominante. Najjar señala que Delta simplemente no era una variante de preocupación cuando estaban desarrollando la plataforma hace unos meses, pero agrega que la velocidad con la que Delta se ha extendido es un testimonio de la necesidad de plataformas de prueba flexibles como miSHERLOCK. Las variantes que importan un mes pueden ser completamente irrelevantes al siguiente, dice.

Más allá del SARS-CoV-2

Con suerte, más temprano que tarde, ya no habrá una necesidad de plataformas de prueba de coronavirus fáciles de usar, pero los investigadores dicen que miSHERLOCK no comenzará a acumular polvo cuando llegue ese momento. El principio del dispositivo se puede utilizar para muchas cosas diferentes, dice de Puig. Si solo cambiamos el ARN guía y algunos componentes, podemos diagnosticar diferentes infecciones. Siempre que haya material de ácido nucleico, dice, se puede construir un ensayo a su alrededor.

Los investigadores dicen que también están pensando en modificar el ensayo para poder procesar diferentes tipos de muestras, incluyendo sangre y orina. Lee dice que ya está trabajando con de Puig y Najjar en la adaptación de miSHERLOCK para diagnosticar la enfermedad febril tropical aguda. Están pensando en tener un dispositivo multiplex que pueda distinguir entre la malaria, el ébola, el dengue, este tipo de cosas que en realidad son clínicamente muy difíciles de distinguir, dice, mediante el uso de este tipo de dispositivo multiplex descentralizado, fácil de distribuir y de bajo costo en entornos que pueden no tienen acceso a formas más tradicionales de pruebas de laboratorio clínico.

El desarrollo de un ensayo SARS-CoV-2 no es novedoso en sí mismo, escribe Parr, y señala el hecho de que múltiples SARS-CoV basados en CRISPR Se han desarrollado dos pruebas y hay un número creciente de ensayos basados en CRISPR que pueden identificar cepas y mutaciones de patógenos específicos. Lo importante de este artículo, dice, es que los autores trabajaron arduamente para que su ensayo fuera simple y fácil de usar, desde la preparación de la muestra hasta la lectura final.