Método de expansión de tejido de próxima generación mejora la imagen neural
eMAP permite etiquetar múltiples proteínas en la misma sinapsis. En un nuevo estudio, los investigadores demostraron etiquetar hasta seis. Aquí vemos tres: Fagot en azul, Piccolo en magenta y PSD-95 en verde. Los tres se combinan en el panel de la derecha. Crédito: Chung Lab/MIT Picower Institute
La gloria de las tecnologías de expansión de tejidos es que cuando las estructuras, como las proteínas que construyen las conexiones de las células nerviosas, son demasiado pequeñas para que las resuelva un microscopio, la química inteligente puede hacer que todo sea más grande y más fácil de ver. . Pero a veces los enlaces químicos involucrados se forman justo donde las etiquetas de anticuerpos fluorescentes deben unirse a las proteínas para hacerlas visibles. Ahora, un equipo de investigadores del MIT ha resuelto el problema, demostrando grandes mejoras en la obtención de imágenes de la estructura de las conexiones neuronales con microscopios confocales estándar.
La actualización se implementa en «eMAP», una versión nueva y mejorada del «análisis ampliado del proteoma» o MAP, tecnología presentada en 2016 por el laboratorio del profesor asociado Kwanghun Chung. La «e» significa conservación de epítopos, lo que significa que es mucho menos probable que se bloqueen los sitios de unión para las etiquetas de anticuerpos fluorescentes. En un artículo reciente en Science Advances, Chung y los coautores muestran que con eMAP, muchas proteínas en las conexiones neuronales, o «sinapsis», ahora se pueden visualizar cuando antes no se podía.
«eMAP conserva el arquitectura molecular a escala fina de las sinapsis y puede facilitar el análisis de alto rendimiento de conjuntos macromoleculares con su excepcional compatibilidad con la gran biblioteca de anticuerpos disponibles en el mercado», informan los científicos, incluidos los autores principales Joha Park, Sarim Khan y Dae Hee Yun. Trabajan con Chung en sus laboratorios que abarcan el Instituto Picower para el Aprendizaje y la Memoria, el Instituto de Ingeniería y Ciencias Médicas y los Departamentos de Ingeniería Química y Ciencias del Cerebro y Cognitivas (BCS) del MIT.
Exposición de epítopos
Las tecnologías de expansión tisular funcionan mediante la infusión de una malla de acrilamida en los tejidos para anclar todas las proteínas de modo que cuando se expande la malla, todas se expanden con ella pero permanecen en el mismo lugar unas con respecto a otras. Las tecnologías típicamente logran ese anclaje con enlaces químicos del formaldehído fijador. El avance clave del equipo con eMAP fue reconfigurar el método para prescindir de esos enlaces químicos a favor de tejer la malla tan finamente, con más acrilamida, que las proteínas simplemente se enredan físicamente con ella. Eso dejó a los preciados epítopos de las proteínas más abiertos para unirse mediante etiquetas de anticuerpos fluorescentes.
«Uno de los descubrimientos que hicimos es que no era necesario introducir componentes de hidrogel durante el paso de perfusión cuando había formaldehído presente». , como lo fue en la realización original de MAP, para lograr una expansión robusta del tejido», dijo Yun.
Park explicó además: «Al eliminar el formaldehído antes de agregar la solución de MAP, podríamos evitar el entrecruzamiento químico entre las proteínas y la malla de hidrogel; podríamos encontrar una condición óptima que pudiera anclar permanentemente las biomoléculas mientras permitía que los anticuerpos se difundieran muy profundamente dentro del tejido».
En las pruebas encontraron que entre las proteínas sinápticas, 49 de 51 Las etiquetas de anticuerpos ahora podían unirse con eMAP, mientras que solo 35 podían hacerlo con MAP.
Usando eMAP, los investigadores etiquetaron componentes de proteínas tanto en el lado presináptico (fagot) como en el lado postsináptico (PSD-95) de una sinapsis excitatoria en un ratón. Crédito: Chung Lab/MIT Picower Institute
Viendo sinapsis
Para explorar el valor neurocientífico de tener estas nuevas capacidades de etiquetado en tejido expandido, el equipo unió fuerzas con dos laboratorios BCS que estudian diferentes sinapsis de mamíferos: la de Elly Nedivi, William R. (1964) & Linda R. Young Professor of Neuroscience, y Guoping Feng, James W. (1963) and Patricia T. Poitras Professor.
Las colaboraciones produjeron imágenes vibrantes, sin necesidad de para cualquier amplificación, de proteínas previamente excluidas, como Bassoon y Piccolo, o que apenas aparecían antes, como Homer1. Las imágenes mostraban claramente cómo se organizaban las proteínas dentro de las sinapsis, lo que permitía medir las distancias relativas entre sí y también su abundancia relativa.
eMAP también permitió obtener imágenes multiescala de sinapsis a lo largo de ramas neuronales completas, o dendritas, lo que significa que fue fácil para los investigadores no solo ver dentro de cada casa de sinapsis metafórica, sino también alejarse a todo el vecindario de la célula completa. Eso es un gran avance para los investigadores, dijo Nedivi, porque los estudios sobre cómo cambian las sinapsis en lo profundo de los cerebros de los animales vivos usan visores de baja resolución cuyas imágenes generalmente deben validarse con métodos de mayor resolución. Tradicionalmente, eso se ha hecho con microscopios electrónicos.
«Preferiría no usar EM, porque requiere mucho trabajo y no combina bien con el etiquetado», dijo Nedivi, miembro del Instituto Picower y Departamentos de Biología y BCS del MIT. «El método de Kwanghun ofrece la oportunidad de obtener el mismo tipo de resolución, pero también de obtener imágenes de un tamaño de muestra mucho mayor por célula».
Además, la tecnología permite múltiples rondas de etiquetado de anticuerpos del mismo tejido, por lo que los científicos pueden etiquetar ricamente muchas proteínas dentro de la misma sinapsis. Trabajando con los laboratorios de Nedivi y Feng, el equipo de Chung demostró el etiquetado de hasta seis proteínas diferentes a lo largo de las sinapsis en dos especies de mamíferos diferentes, mostrando cómo están dispuestas a lo largo de las estructuras en ambos lados de la sinapsis.
Nedivi y Los laboratorios de Chung también demostraron que al etiquetar los componentes de los receptores del neurotransmisor GABA en las sinapsis inhibidoras (llamadas así porque reducen la probabilidad de que una neurona produzca una señal eléctrica), podían examinar si difieren. De hecho, encontraron que un poco más de la mitad de las sinapsis inhibidoras tienen los dos componentes que buscaban, pero una cuarta parte no tenía ninguno y algunos solo tenían uno o el otro.
«Estos hallazgos confirman que las sinapsis inhibidoras no son homogéneos en su contenido molecular y muestran que eMAP es una herramienta poderosa para el interrogatorio cuantitativo del proteoma sináptico», escribieron los autores.
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La nueva técnica puede revelar detalles del cerebro subcelular y conexiones de largo alcance Más información: Joha Park et al, Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP), Science Advances ( 2021). DOI: 10.1126/sciadv.abf6589 Información de la revista: Science Advances
Proporcionado por el Instituto Tecnológico de Massachusetts Cita: El método de expansión de tejido de próxima generación mejora la imagen neuronal (2022, 13 de enero) recuperado el 29 de agosto de 2022 de https://medicalxpress.com/news/2022-01-next-generation-tissue-expansion-method-neural.html Este documento está sujeto a derechos de autor. Aparte de cualquier trato justo con fines de estudio o investigación privados, ninguna parte puede reproducirse sin el permiso por escrito. El contenido se proporciona únicamente con fines informativos.