Secuenciación de ARN de una sola célula desarrollada para cuantificar con precisión los efectos de fármacos específicos de las células en los islotes pancreáticos

Flujo de trabajo de identificación y eliminación de lecturas contaminantes en la secuenciación de células unicelulares y las respuestas de fármacos específicas del tipo de células de los islotes de los perfiles descontaminados. Crédito: Brenda Marquina-Snchez y Nikolaus Fortelny / CeMM

El páncreas es un órgano abdominal que produce enzimas digestivas y hormonas que regulan los niveles de azúcar en la sangre. Esta función productora de hormonas se localiza en los islotes de Langerhans, que constituyen grupos de diferentes tipos de células endocrinas. Entre ellas se encuentran las células beta, que producen la hormona insulina necesaria para bajar los niveles de glucosa (un tipo de azúcar) en nuestra sangre, así como las células alfa, que generan la hormona glucagón encargada de elevar los niveles de glucosa en sangre.

La diabetes tipo 1 es una enfermedad crónica en la que el sistema inmunitario del cuerpo ataca y destruye por error las células beta productoras de insulina del páncreas. La medicina regenerativa tiene como objetivo reponer la masa de células beta y, por lo tanto, respaldar y, en última instancia, sustituir las terapias de reemplazo de insulina actuales. Las alteraciones en la composición de los islotes, incluida la función insuficiente de las células beta y la desdiferenciación de las células beta, también contribuyen a la diabetes tipo II. Por lo tanto, una comprensión más profunda de la identidad y la diafonía de los diferentes tipos de células de los islotes conduce a una mejor caracterización de ambas formas de diabetes y puede contribuir al desarrollo de nuevos conceptos terapéuticos.

La transcriptómica unicelular es una poderosa técnica para caracterizar la identidad celular. Anteriormente, los investigadores de CeMM de los grupos de Christoph Bock y Stefan Kubicek en CeMM publicaron los primeros transcriptomas de células individuales de células primarias de islotes pancreáticos humanos (EMBO Rep). Desde entonces, los avances en la tecnología han permitido su aplicación a la generación de atlas globales de transcriptoma de células individuales humanas y de ratón. A pesar de estos avances, los enfoques de células individuales siguen siendo un desafío tecnológico dado que la minúscula cantidad de ARN presente se agota por completo en el experimento. Por lo tanto, es esencial garantizar la calidad y la pureza de los transcriptomas de células individuales resultantes.

Los investigadores del CeMM en los dos laboratorios contribuyentes identificaron una expresión hormonal inesperadamente alta en tipos de células no endocrinas, tanto en su propio conjunto de datos como en así como otros estudios de células individuales publicados. Se propusieron dilucidar si esto sería el resultado de la contaminación por moléculas de ARN, por ejemplo, de células moribundas, y cómo podría eliminarse para obtener un conjunto de datos más confiable. Tal contaminación parece estar presente en los datos de RNA-seq de una sola célula de la mayoría de los tejidos, pero fue más visible en los islotes pancreáticos. Las células endocrinas de los islotes se dedican exclusivamente a la producción de hormonas individuales, y la insulina en las células beta y el glucagón en las células alfa se expresan en niveles más altos que los genes típicos de «limpieza». Por lo tanto, la redistribución de estas transcripciones a otros tipos de células fue muy pronunciada. Basándose en esta observación, su objetivo era desarrollar, validar y aplicar un método para determinar experimentalmente y eliminar computacionalmente dicha contaminación.

En su investigación, los investigadores del CeMM utilizaron células enriquecidas de diferentes tipos de células, tanto de ratón como de ratón. y muestras humanas, que agregaron a sus muestras de islotes pancreáticos. Es importante destacar que los transcriptomas de estas células de inserción se caracterizaron por completo. Esto les permitió controlar internamente y con precisión el nivel de contaminación de ARN en RNA-seq de una sola célula, lo que da que las transcripciones humanas detectadas en las células de ratón constituyen ARN contaminante. De esta forma, encontraron que las muestras tenían un nivel de contaminación de hasta el 20%, y pudieron definir la contaminación en cada muestra. Luego desarrollaron un enfoque bioinformático novedoso para eliminar computacionalmente lecturas contaminantes de transcriptomas de células individuales.

Habiendo obtenido ahora un transcriptoma «descontaminado», del que se eliminó la señal espuria, procedieron a caracterizar cómo la identidad celular en los diferentes tipos celulares respondieron al tratamiento con tres fármacos diferentes. Descubrieron que un inhibidor de molécula pequeña del factor de transcripción FOXO1 induce la desdiferenciación de las células alfa y beta. Además, estudiaron el arteméter, que se había descubierto que disminuía la función de las células alfa y podía inducir la producción de insulina tanto en estudios in vivo como in vitro (Cell). Los efectos del fármaco arteméter fueron específicos de la especie y del tipo de célula. En las células alfa, una fracción de células aumenta la expresión de insulina y adquiere aspectos de la identidad de las células beta, tanto en muestras de ratón como de humanos. Es importante destacar que los investigadores encontraron que en las células beta humanas no hay cambios significativos en la expresión de insulina, mientras que en los islotes de ratón, las células beta reducen su expresión de insulina y la identidad general de las células beta.

Este estudio es el resultado de una colaboración interdisciplinar de los laboratorios de Stefan Kubicek y Christoph Bock en CeMM con Patrick Collombat en el Instituto de Biología Valrose (Francia). Este es el primer estudio que aplica secuenciación de células individuales para analizar la respuesta dinámica a fármacos en tejido aislado intacto, que se benefició de la alta precisión cuantitativa del método de descontaminación. Por lo tanto, proporciona no solo un método novedoso para la descontaminación de células individuales y el análisis de células individuales altamente cuantitativo de las respuestas a fármacos en tejidos intactos, sino que también aborda una cuestión actual importante en la biología de las células de los islotes y la investigación de la diabetes. Estos hallazgos podrían abrir posibles vías terapéuticas para tratar la diabetes tipo 1 en el futuro.

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Células beta a partir de células madre: potencial para la terapia de reemplazo celular Más información: Brenda Marquina-Sanchez et al, Single-cell RNA-seq with spike-in cells permite cuantificación de los efectos de fármacos específicos de células en los islotes pancreáticos, Genome Biology (2020). DOI: 10.1186/s13059-020-02006-2

Jin Li et al. Los transcriptomas de una sola célula revelan rasgos característicos de los tipos de células de los islotes pancreáticos humanos, informa EMBO (2015). DOI: 10.15252/embr.201540946

Jin Li et al. Las artemisininas se dirigen a la señalización del receptor GABA A y alteran la identidad celular, Cell (2016). DOI: 10.1016/j.cell.2016.11.010 Información de la revista: Cell , Genome Biology , EMBO Reports